Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
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Wir danken Prof. Ivana Novak und Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Universität Kopenhagen) für den Zugang zum Mikroskop. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat unterstützt (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR und JTE); ein Promotionsstipendium der Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); der Schwedische Forschungsrat (2017-03389; CDM); die Schwedische Krebsgesellschaft, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj und 190007; CDM); Deutsche Krebshilfe(dpa) RR); und die Dänische Krebsgesellschaft (R204-A12454; RR).

Alle hier enthaltenen Verfahren wurden von der Ethikkommission zur Regulierung der experimentellen Medizin an der Universität Kopenhagen überprüft und genehmigt und stimmen mit der dänischen und europäischen Gesetzgebung überein. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, haben wir weibliche BALB/cJ-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und eine MMTV-PyMT-Maus im Alter von 11 Wochen verwendet.
HINWEIS: Die Vermeidung einer bakteriellen Kontamination des dezellularisierten ECM-Gerüsts liefert das b...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

Dezellularisierungstechniken, die auf Gewebebewegung basieren, verändern die ECM-Struktur, wodurch sie für die ECM-Strukturanalyse ungeeignet sind4. Die Perfusionsdezellularisation unter Verwendung eines anatomischen Weges wie der Aorta der Luftröhre ermöglicht es, das Kapillarbett oder die terminalen Alveolen zu erreichen und erleichtert die Abgabe von Dezelluliermitteln im gesamten Organ. Die Verwendung von zwitterionischen, anionischen und nichtionischen Detergenzien zur Dezellularisierung ...

Das ECM ist ein dreidimensionales Netzwerk aus Proteinen und Glykanen, das alle Zellen in einem vielzelligen Organismus beherbergt, Organen ihre Form verleiht und das Zellverhalten während des gesamten Lebens reguliert1. Ab der Eizellbefruchtung bauen und modellieren Zellen das ECM und werden wiederum streng von ihm kontrolliert. Der Zweck dieses Protokolls ist es, eine Möglichkeit zur Analyse und Kartierung von Maus-ECM zu eröffnen, da Mäuse der am häufigsten verwendete Modellorganismus in der Pathophysiologie von Säugetieren sind.
Die Entwicklung dieser Methode wurde durch die Notwendigkeit vorangetrieben, Metastasen-assoziiertes natives ECM2 zu charakterisieren und zu isolieren. Da Tumoren keine richtige anatomische Vaskularisierung fehlt und Mäuse relativ kleine Organismen sind, wurden mikrochirurgische Verfahren entwickelt, um die Aorta retrograd zu katheterisieren, während die Zirkulation des Hauptgefäßes, das zu einem Tumor führt (z. B. die Lungenvenen), isoliert wird, wodurch der Reagenzfluss fokussiert und die Tumordezellularisation ermöglicht wird. Diese Methode erzeugt ECM-Gerüste mit einer konservierten Struktur2, die immungefärbt und abgebildet werden können, was eine ECM-Strukturkartierung im Submikrometer-Detail ermöglicht. Um dieses Protokoll durchzuführen, ist es notwendig, chirurgische und mikrochirurgische Fähigkeiten (Dissektion, Mikroernährung und Katheterisierung) zu erwerben, die eine mögliche Einschränkung seiner Verwendung darstellen können. Unseres Wissens stellt diese Methode den Stand der Technik für die native ECM-Strukturbildgebung dar2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

Wir präsentieren hier ein Dezellularisierungsprotokoll für Mausherz und -lunge. Es produziert strukturelle ECM-Gerüste, die zur Analyse der ECM-Topologie und -Zusammensetzung verwendet werden können. Es basiert auf einem mikrochirurgischen Verfahren, das entwickelt wurde, um die Luftröhre und Aorta einer eingeschläferten Maus zu katheterisieren, um Herz und Lunge mit Dezellularisierungsmitteln zu durchdringen. Der dezellularisierte kardiopulmonale Komplex kann anschließend immungefärbt werden, um die Position struktureller ECM-Proteine aufzudecken. Das gesamte Verfahren kann in 4 Tagen abgeschlossen werden.
Die aus diesem Protokoll resultierenden ECM-Gerüste sind frei von Dimensionsverzerrungen. Das Fehlen von Zellen ermöglicht die strukturelle Untersuchung von ECM-Strukturen bis hin zur Submikronauflösung in 3D. Dieses Protokoll kann auf gesundes und krankes Gewebe von Mäusen im Alter von 4 Wochen angewendet werden, einschließlich Mausmodellen für Fibrose und Krebs, was den Weg zur Bestimmung des ECM-Remodelings im Zusammenhang mit kardiopulmonalen Erkrankungen ebnet.

Kardiopulmonale Dezellularisation Nach erfolgreichem Abschluss des Protokolls werden Herz und Lunge sowie das Begleitgewebe wie der Aortenbogen frei von Zellen sein. Die Dezellularisation kann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung (Abbildung 1) der ECM-Gerüste validiert werden, die die Entfernung der Kerne im Vergleich zum nativen Gewebe zeigen. Diese Gerüste behalten die Abmessungen frischer Organe bei und ihre unlösliche ECM-Struktur ist ...

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Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Dieses Protokoll zielt darauf ab, das Herz und die Lunge von Mäusen zu dezellularisieren. Die resultierenden Gerüste der extrazellulären Matrix (ECM) können immungefärbt und abgebildet werden, um die Position und Topologie ihrer Komponenten abzubilden.

Dezellularisation des murinen Kardiopulmonalkomplexes

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Dieses Protokoll ist das Tor zur extrazellulären Matrix. Es ist Komplexität und ihre Struktur bis in den Submikron-Maßstab. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht also darin, dass sie es ermöglicht, eine extrazelluläre Matrix zu erhalten, die ihre strukturelle Integrität beibehält und so den Weg für biochemische und anatomische Analysen ebnet.Das Verfahren werden von Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten und Maria Rafaeva, derzeit in meinem Labor und Chris Madsen, der in meinem Labor war und die Arbeit an der Universität Lund fortsetzte, demonstriert. Beginnen Sie mit der Rasur des Brustkorbs, des Bauches und des Rückens der eingeschläferten Maus mit einer Haarschneidemaschine. Desinfizieren Sie den Bereich mit 70% Ethanol.Dann befestigen Sie die Maus an einer Styroporschale und verlängern Sie ihre vier Hinterbeine sowie kopf und schwanz. Legen Sie es unter das mikrochirurgische Mikroskop. Machen Sie mit einer Mayo-Schere mit geradem Muster einen Hautschnitt, der von der submandibulären Region zum Unterbauch verläuft, und sezieren Sie subkutan, um die Brustwand und das Peritoneum freizulegen.Verwenden Sie dann eine mikrochirurgische Schere, um die Muskeln Pectoralis major und Pectoralis minor entlang des sechsten Interkostalraums auf beiden Seiten der Brustwand zu schneiden. Schneiden Sie das Brustbein entlang der vorherigen Schnitte mit einer geraden Musterschere. Schließen Sie dann eine Sternotomie ab, indem Sie das Brustbein entlang seiner Längsachse schneiden.Heben und stiften Sie beide Seiten der Brustwand, um den kardiopulmonalen Komplex freizulegen. Verwenden Sie eine runde Mikrozange, um den Thymus und das umgebende Fettgewebe zu entfernen, indem Sie sie vorsichtig von ihren Anbauteilen abziehen. Und schneiden Sie die Speiseröhre mit einer Mikroschere ab.Trennen Sie die brachiozephalen Venen und die Arteria brachiocephalica mit einer scharfen Mikrozange. Trennen Sie dann die linken gemeinsamen Carotis- und linken Subclaviaarterien vom darunter liegenden Gewebe, um die Ligatur und Kauterisation zu erleichtern. Verwenden Sie einen Mikronadelhalter und eine scharfe Mikrozange und eine Neun-Oh-Naht, um Stiche über die Entstehung der brachiocephalen linken Halsschlagader und der linken Subclavia-Arterien zu legen, kauterisieren Sie die brachiozephalen Venen.Öffnen Sie mit einer Mikroschere einen Eingang, indem Sie das Band schneiden. Führen Sie einen 27-Gauge-Katheter in die Luftröhre ein und drücken Sie vorsichtig, bis sich die Luftröhre in die Bronchien verzweigt, wobei darauf zu achten ist, dass die Bronchien nicht gestört werden. Legen Sie mit einer Sechs-O-Naht drei Stiche um die Luftröhre, um den Katheter zu sichern.Schnitt die Maus auf Höhe des 12. Brustwirbels, verläuft die absteigende Aorta anterior zur Wirbelsäule und sollte hier zusammen mit der Wirbelsäule geschnitten werden. Katheterisieren Sie die Aorta retrograd und drücken Sie den Katheter, bis er den Aortenbogen erreicht. Legen Sie mit einer Naht vier Stiche um die Aorta, beginnend fünf Millimeter unterhalb der Katheterspitze.Schließen Sie die Maus über Silikonschläuche und untere Anschlüsse an ein Pumpensystem an. 15 Minuten lang mit entionisiertem Wasser bei 200 Mikrolitern pro Minute perfundieren. Wechseln Sie dann das Perfusionsmittel zu 0,5% DOC, verdünnen Sie es in deionisiertem Wasser und perfundieren Sie es über Nacht.Wechseln Sie am nächsten Tag das Perfusionsmittel auf 0,1% SDS, verdünnt in entionisiertem Wasser, und perfundieren Sie es acht Stunden lang. Dann 24 Stunden lang mit deionisiertem Wasser perfundieren, um das SDS und DOC wegzuspülen. Resezieren Sie das dezellularisierte Herz und die Lunge, indem Sie seine Anhaftungen am Thorax schneiden.Lagern Sie das Gewebe in einem sterilen Kryoröhrchen in deionisiertem Wasser mit 1% PenicillinStrptomycin und 0,3 mikromolarem Natriumazid bei vier Grad Celsius. Um eine Immunfärbung durchzuführen, blockieren Sie die Probe, indem Sie sie in einem Kryoröhrchen mit 6% Eselserum und 3% BSA über Nacht inkubieren. Dann mit primärem Antikörper in 3% Eselserum in PBS für 24 Stunden inkubieren.Nach der Inkubation die Probe fünfmal in PBST für eine Stunde pro Wäsche waschen. Inkubieren Sie die Probe mit fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern in 3% Eselserum in PBS für 24 Stunden. Wiederholen Sie dann die Wäschen in PBST.Fügen Sie das ionisierte Wasser hinzu und lagern Sie die Probe bei vier Grad Celsius vor direktem Licht geschützt. Um die Probe abzubilden, legen Sie sie in eine Glasbodenschale und befeuchten Sie sie mit zwei Tröpfchen Lagerlösung. Stellen Sie das Objektiv ein und untersuchen Sie die Probe mit Fluoreszenzlicht.Wechseln Sie zur Computersteuerung, schalten Sie Laser ein und passen Sie Laserintensität, Lochblende, Wellenlänge, Verstärkung, Auflösung und Zoom an. Legen Sie die Anzahl und Schrittweite für den Z-Stack fest und beginnen Sie dann mit der Erfassung. Schneiden Sie einen Lungenlappen aus einer eingeschläferten Maus heraus und legen Sie ihn in eine 10 x 10 x fünf Millimeter große Kryoform.Bedecken Sie es mit etwa 500 Meilen Mikroliter OCT-Compound und frieren Sie es auf Trockeneis ein. Halten Sie die Probe auf dieser Temperatur. Schneiden Sie einen dezellularisierten Lungenlappen aus einer verarbeiteten Maus heraus, legen Sie ihn in eine Kryoform mit der größten Oberfläche nach unten und bedecken Sie ihn mit OCT-Verbindung.Frieren Sie die Probe auf Trockeneis ein und halten Sie sie auf dieser Temperatur, bis dies anderweitig erforderlich ist. Die Probe kann mindestens 12 Wochen gelagert werden. Verwenden Sie einen Kryostaten, um gefrorene Gewebeblöcke bei minus 20 Grad Celsius in fünf Mikrometerabschnitte zu schneiden.Und platzieren Sie die Abschnitte auf Glasklebeobjektträgern. Die Folien auf Raumtemperatur bringen, bis die Luft getrocknet ist. Tauchen Sie die Objektträger kurz in PBS ein, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten.Einmal in PBS waschen, dann zweimal in destilliertem Wasser für fünf Minuten pro Waschgang. Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in die Hämatoxylinlösung von Myer ein. Als nächstes waschen Sie die Objektträger in einem Copeland-Glas unter fließendem destilliertem Wasser für 10 Minuten und tauchen Sie sieben Minuten in Eosinlösung ein.Mehrmals in Xylol tauchen. Tragen Sie ein paar Tropfen DPX-Montagemedium auf und legen Sie einen Glasabdeckungszettel auf. Lassen Sie die Dias über Nacht unter einer chemischen Haube trocknen und scannen Sie sie dann in einem Diascanner.Nach erfolgreichem Abschluss des Protokolls sind Herz und Lunge sowie NX-Gewebe frei von Zellen. Die Dezellularisation kann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung der ECM-Gerüste validiert werden. Die Gerüste behalten die Abmessungen von frischen Organen bei und ihre unverträgliche ECM-Struktur ist intakt.ECM-Gerüste zeigten eine erhöhte Durchlässigkeit und Lichtdurchdringbarkeit. Die Verwendung dieses Protokolls mit einem motorisierten Mikroskoptisch ermöglicht die dreidimensionale kachelte Abbildung ganzer Mount-Proben mit einer Auflösung im Submikrometerbereich. Es ist wichtig, den Fluss zu den interessierenden Organen zu meiden, um eine vollständige gleichmäßige Enteignung zu erreichen.Die mikrochirurgische Dissektion und Ligatur von Gefäßen muss wirksam sein. Und respektieren Sie gleichzeitig die Zielgewebe, um die native VCM-Struktur aufrechtzuerhalten. Nach diesem Verfahren werden die Gerüste für strukturelle ECM-Proteine angereichert und können für die Massenspektrometrie oder das Tissue Engineering verwendet werden.Diese Technik ebnet den Weg zur hochauflösenden Abbildung der extrazellulären Matrix.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Ein Maus-Modell der Fatigue, induziert durch Peripheral Bestrahlung

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Forschung

Krebsforschung

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Murine Modell der metastasierenden Lebertumoren in der Einstellung der Ischämie Reperfusionsverletzung

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Einrichtung einer gentechnisch veränderten Murine Kopf- und Halskrebszelllinie mit einem Adeno-assoziierten Virus-Cas9-System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation und Beurteilung des Melanoms in der Aderhaut der Maus mittels optischer Kohärenztomographie

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitochondriale Cybrid-Generierung mit Hilfe von Krebszelllinien

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...