Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

אנו מודים לפרופ' איוונה נובאק וד"ר נין מיין כריסטנסן (המרכז להנפשה ביולוגית מתקדמת (CAB), אוניברסיטת קופנהגן) על מתן גישה למיקרוסקופ. עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR ו- JTE); מלגת דוקטורט מקרן לונדבק (R286-2018-621; מר); מועצת המחקר השוודית (2017-03389; CDM); האגודה השבדית לסרטן, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, ו- 190007; CDM); סיוע גרמני לסרטן (דויטשה קרבשילפה; RR); והאגודה הדנית לסרטן (R204-A12454; ר.ר).

כל ההליכים הכלולים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית המסדירה את הרפואה הניסיונית באוניברסיטת קופנהגן ומסכימה עם החקיקה הדנית והאירופאית. כדי להדגים פרוטוקול זה, השתמשנו בעכברים נקבות BALB / cJ של 8-12 שבועות של עכבר נקבה MMTV-PyMT של גיל 11 שבועות.
הערה: הימנעות מזיהום חיידקי של פי?...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

טכניקות Decellularization המבוססות על תסיסה רקמה לשנות מבנה ECM, מה שהופך אותם לא מתאים לניתוח מבנה ECM4. דטרמינוליזציה זלוף, באמצעות מסלול אנטומי כגון אב העורקים של קנה הנשימה, מאפשר להגיע למיטה נימי, או alveoli סופני, ומאפשר את המסירה של סוכנים decellularizing ברחבי האיבר. השימוש zwitterionic, אניוני ולא...

ה- ECM היא רשת תלת ממדית העשויה מחלבונים וגליקנים המתאימה לכל התאים באורגניזם רב-תאי, המעניקה לאיברים את צורתם ומווסתת את התנהגות התאים לאורך החיים1. מהפריית ביצית ואילך, תאים בונים ומשפצים את ה- ECM, והם נשלטים בקפדנות על ידי זה. מטרת פרוטוקול זה היא לפתוח דרך לנתח ולמפה את עכבר ECM, שכן עכברים הם האורגניזם המודל הנפוץ ביותר בפתופיזיולוגיה של יונקים.
ההתפתחות של שיטה זו הונעה על ידי הצורך לאפיין ולבודד ECM2 יליד גרורות הקשורים גרורות. כמו גידולים חסרים כלי דם אנטומיים נאותים ועכברים הם אורגניזמים קטנים יחסית, הליכים מיקרוכירורגיים תוכננו כדי להצטמצם בנסיגה של אב העורקים, תוך בידוד זרימת הכלי העיקרי המוביל לגידול (למשל, ורידים ריאתיים), ובכך למקד את זרימת ריאגנט ומאפשר דפלולרציה של הגידול. שיטה זו מייצרת פיגומי ECM עם מבנה שמור2 שניתן לחסן ולדמות, ומאפשרת מיפוי מבנה ECM בפירוט תת-מיקרון. כדי לבצע פרוטוקול זה, יש צורך לרכוש מיומנויות כירורגיות ומיקרוכירורגיות (ניתוח, מיקרו-uturing וצנתור) שעשויים לייצג מגבלה פוטנציאלית לשימוש בו. למיטב ידיעתנו, שיטה זו מייצגת את הארגון החדיש ביותר עבור ניתוח הדמיית מבנה ECM מקורי2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

אנו מציגים כאן פרוטוקול דפלולרציה ללב העכבר ולריאות. הוא מייצר פיגומי ECM מבניים שניתן להשתמש בהם כדי לנתח טופולוגיה והרכב ECM. הוא מבוסס על הליך מיקרו-כירורגי שנועד לצנתר את קנה הנשימה ואת אב העורקים של עכבר מורדם כדי לשוטט בלב ובריאות עם חומרים מנטרלים. קומפלקס קרדיו-ריאות decellularized לאחר מכן ניתן לחסן כדי לחשוף את המיקום של חלבוני ECM מבניים. ניתן להשלים את כל ההליך ב-4 ימים.
פיגומי ECM הנובעים מפרוטוקול זה נקיים מעיוותים ממדיים. היעדר תאים מאפשר בדיקה מבנית של מבני ECM עד לרזולוציית תת-מיקרון בתלת-ממד. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רקמה בריאה וחולנית מעכברים בגיל 4 שבועות, כולל מודלים עכבר של פיברוזיס וסרטן, פתיחת הדרך כדי לקבוע ECM שיפוץ הקשורים למחלות לב ריאה.

דפלולרציה לב-ריאה לאחר השלמת הפרוטוקול בהצלחה, הלב והריאות, כמו גם רקמת נספח כגון קשת העורקים, יהיו נקיים מתאים. ניתן לאמת את ההקטוקסילין-אאוזין (איור 1) של פיגומי ECM המראים הסרה של הגרעינים בהשוואה לרקמה המקורית. פיגומים אלה שומרים על מידותיהם ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

פרוטוקול זה נועד לבטל את הלב והריאות של עכברים. ניתן לחסן ולדמות את הפיגומים החוץ-תאיים (ECM) המתקבלים כדי למפות את המיקום והטופולוגיה של הרכיבים שלהם.

דקלולריזציה של קומפלקס הקרדיו-ריאות מורין

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

פרוטוקול זה הוא השער למטריצה החוץ-תאית. זה המורכבות והמבנה שלו עד לסולם תת מיקרון. אז היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת להשיג מטריצה חוץ תאית ששומרת על השלמות המבנית שלה ובכך פותחת את הדרך לניתוח ביוכימי ואנטומי.בהדגמת ההליך יהיו אלחנדרו מאיורקה ג'ילאני, רפאל רויטן ומריה ראפיבה, שנמצאים כרגע במעבדה שלי וכריס מדסן שהיה במעבדה שלי והמשיך את העבודה באוניברסיטת לונד. התחל על ידי גילוח בית החזה, הבטן והחלק האחורי של העכבר המתת חסד עם קוצץ שיער. לחטא את האזור עם 70% אתנול.לאחר מכן הצמידו את העכבר למגש פוליסטירן, המרחיב את ארבע הגפיים האחוריות הקצות שלו, כמו גם את ראשו וזנבו. מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ המיקרו-כירורגיה. באמצעות מספריים דפוס ישר מאיו, לעשות חתך עורי פועל מאזור הלסת התחתונה לבטן התחתונה ולנתח תת עורית כדי לחשוף את דופן בית החזה ואת הצפק.לאחר מכן השתמש במספריים מיקרוכירורגיים כדי לחתוך את שרירי החזה העיקריים והדקטריים לאורך החלל הבין-צילומי השישי משני צידי דופן דופן בית החזה. חותכים את החזה לאורך החתכים הקודמים עם מספריים דפוס ישר. לאחר מכן להשלים כריתת החזה על ידי חיתוך ציר החזה לאורך צירו הארוך.הגבהו והצמידו, משני צידי דופן בית החזה כדי לחשוף את תסביך הלב-ריאה. השתמש במלקחיים מיקרו עגולים כדי לחתוך את התימוס ואת רקמת השומן שמסביב על ידי משיכה עדינה שלהם את ההחזקות שלהם. ולחתוך את הוושט עם מספריים זעירות.להפריד את הוורידים brachiocephalic ואת העורק brachiocephalic עם מלקחיים מיקרו חדים. לאחר מכן להפריד את העורק הראשי המשותף השמאלי ואת העורקים התת-בריקליים השמאליים מן הרקמה הבסיסית כדי להקל על קשירה וצרוב. השתמש מחזיק microneedle מלקחיים מיקרו חדים תשעה הו תפר להניח תפרים מעל הופעתה של brachiocephalic עזב עורקים נפוצים והעורקים התת-בריקליים שמאל, לצרוב את הוורידים brachiocephalic.באמצעות מספריים מיקרו, לפתוח כניסה על ידי חתך הרצועה. הכניסו קטטר 27 מד לתוך קנה הנשימה ולדחוף בעדינות עד קנה הנשימה מסתעף לתוך הסימפונות, דואג לא לשבש את הסימפונות. בעזרת תפר של שישה O, מניחים שלושה תפרים סביב קנה הנשימה כדי לאבטח את הצנתר.קטע את העכבר בגובה החוליה החזה ה -12, אב העורקים היורד פועל בקו הקדמי לעמוד השדרה ויש לחלק אותו כאן יחד עם עמוד השדרה. מצמצם בנסיגה את בן העורקים ולדחוף את הצנתר עד שהוא מגיע לקשת של בכושר העורקים. בעזרת תפר, מניחים ארבעה תפרים סביב באבי העורקים, החל מחמישה מילימטרים מתחת לקצה הצנתר.חבר את העכבר למערכת משאבה באמצעות צינורות סיליקון ומחברים נמוכים יותר. יש לטפס עם מים דה-תיוניים ב-200 מיקרוליטרים לדקה במשך 15 דקות. לאחר מכן לשנות את סוכן זלוף ל 0.5%DOC, מדולל במים deionized ולפרפר בן לילה.למחרת, לשנות את סוכן זלוף ל 0.1%SDS מדולל במים deionized, ולפרוט במשך שמונה שעות. לאחר מכן לעיין במים דה-יונים במשך 24 שעות כדי לשטוף את ה- SDS וה- DOC.לאחסן את הרקמה בצינור קריו סטרילי במים deionized עם 1% פניצילין סטרפטומיצין ו 0.3 מיקרומולר נתרן אזיד בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע כתמי אימונו, לחסום את המדגם על ידי דגירה אותו בצינור הקפאה המכיל 6% סרום חמור ו 3% BSA לילה. ואז לדגור עם נוגדן ראשוני בסרום חמור 3% ב PBS במשך 24 שעות.לאחר הדגירה לשטוף את המדגם חמש פעמים PBST במשך שעה אחת לכל לשטוף. לדגור על המדגם עם נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי בסרום חמור 3% ב- PBS במשך 24 שעות. ואז לחזור על הכביסות ב PBST.מוסיפים את המים היונים ומאחסנים את המדגם במרחק של ארבע מעלות צלזיוס מאור ישיר. כדי לדמיין את המדגם, מניחים אותו בצלחת תחתונה מזכוכית ולח אותו עם שתי טיפות של פתרון אחסון. הגדר את המטרה ולבדוק את המדגם באמצעות אור פלואורסצנטיות.עבור לבקרת מחשב, הפעל לייזרים והתאם את עוצמת הלייזר, צמצם חור הסיכה, אורך הגל של הגל, הרווח, הרזולוציה וההזום. הגדר את המספר ואת גודל השלב עבור מחסנית Z ולאחר מכן להתחיל רכישה. מוציאים אונת ריאה אחת מעכבר מורדם ומניחים אותה בתבנית קריו 10 על 10 על 5 מ"מ.לכסות אותו עם כ 500 קילומטר microliters של תרכובת OCT ולהקפיא אותו על קרח יבש. שמור על הדגימה בטמפרטורה הזאת. Excise אונת ריאות אחת decellularized מעכבר מעובד, למקם אותו בתבנית קריו עם שטח הפנים הגדול ביותר למטה לכסות אותו עם תרכובת OCT.להקפיא את המדגם על קרח יבש ולשמור אותו בטמפרטורה זו עד שנדרש אחרת. ניתן לאחסן את הדגימה למשך 12 שבועות לפחות. השתמש cryostat כדי סעיף בלוקים רקמה קפואה לחמישה מקטעי מיקרומטר במינוס 20 מעלות צלזיוס.ומניחים את המקטעים על שקופיות זכוכית דבק. מעבירים את השקופיות לטמפרטורת החדר עד שהאוויר מתייבש. לטבול בקצרה את השקופיות PBS, ואחריו 4%paraformaldehyde ב- PBS במשך 15 דקות.לשטוף פעם אחת PBS, ולאחר מכן פעמיים במים מזוקקים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לטבול את השקופיות בפתרון המטוקסילין של מאייר במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות בצנצנת קופלנד תחת מים מזוקקים זורמים במשך 10 דקות לטבול בתמיסת אאוזין במשך שבע דקות.טובלים בקסילן מספר פעמים. יש למרוח כמה טיפות של הרכיבה על DPX בינונית ולהניח פתק כיסוי מזכוכית. השאר את השקופיות להתייבש לילה מתחת למכסה המנוע הכימי ולאחר מכן לסרוק אותם בסורק שקופיות.לאחר השלמת הפרוטוקול בהצלחה, הלב והריאות ורקמת NX יהיו נקיים מתאים. Decellularization יכול להיות מאומת על ידי המטוקסילין אאוזין כתמים של פיגומי ECM. הפיגומים שומרים על מידותיהם של איברים טריים ומבנה ה- ECM הניתן להתגלות שלו אינו נפגע.פיגומי ECM הראו חמיאות מוגברת וחבובות אור. שימוש בפרוטוקול זה עם שלב מיקרוסקופ ממונע מאפשר הדמיה תלת ממדית של דגימות הרכבה שלמות ברזולוציית תת מיקרון. זה חיוני כדי להתרחק זרימה לכיוון האיברים של עניין כדי להשיג decellurization אחיד מלא.הניתוח המיקרו-כירורגי וקשירת כלי הדם חייבים להיות יעילים. ובאותו הזמן לכבד את רקמות היעד כדי לשמור על מבנה VCM מקומי. בעקבות הליך זה, הפיגומים יועשרו לחלבוני ECM מבניים וניתן להשתמש בהם לספקטרומטריית מסה או להנדסת רקמות.טכניקה זו סוללת את הדרך למיפוי ברזולוציה גבוהה של המטריצה החוץ-תאית.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

במודל עכבר של עייפות הנגרם על ידי הקרנה ההיקפית

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

דור ובידוד של מחזור התא נעצר תאים עם Karyotypes מורכבים

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

דגם Syngeneic Orthotopic זוהרים, פלורסנט מאתר של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

מודל מורנה של גידולים גרורות בכבד בהגדרה של איסכמיה Reperfusion פציעה

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

בשנת הקמת מבחנה של הראש מהונדסים גנטית מורה וצוואר הסרטן קו תא באמצעות Adeno משויך וירוס-Cas9 מערכת

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

איתור דנ"א ללא תאים בדגימות פלזמה בדם של חולי סרטן

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

השתלה והערכה של מלנומה בכורואיד מורין באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...