Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
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हम प्रोफेसर इवाना नोवाक और डॉ Nynne Meyn Christensen (उन्नत Bioimaging (सीएबी), कोपेनहेगन विश्वविद्यालय के लिए केंद्र) माइक्रोस्कोप पहुँच प्रदान करने के लिए धन्यवाद. इस काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN) द्वारा समर्थित किया गया था; एईएम-जी, ओडब्ल्यू, आरआर और जेटीई); लुंडबेक फाउंडेशन (R286-2018-621) से पीएचडी फैलोशिप; MR); स्वीडिश अनुसंधान परिषद (2017-03389; सीडीएम); स्वीडिश कैंसर सोसायटी, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, और 190007; सीडीएम); जर्मन कैंसर सहायता (ड्यूश Krebshilfe; आरआर); और डेनिश कैंसर सोसायटी (R204-A12454; आरआर)।

यहां शामिल सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई है और कोपेनहेगन विश्वविद्यालय में प्रयोगात्मक चिकित्सा को विनियमित करने वाली नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और डेनिश और यूरोपीय कानून से सहमत है?...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

ऊतक आंदोलन के आधार पर डीसेल्युलराइजेशन तकनीकें ईसीएम संरचना को बदल देती हैं, जिससे उन्हें ईसीएम संरचना विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त बना दिया जाता है। परफ्यूजन डीसेल्युलराइजेशन, ट्रेकिआ के महा...

ईसीएम एक तीन आयामी नेटवर्क है जो प्रोटीन और ग्लाइकन से बना है जो एक बहुकोशिकीय जीव में सभी कोशिकाओं को समायोजित करता है, अंगों को उनका आकार देता है और पूरे जीवन में सेल व्यवहार को विनियमित करता है। अंडे के निषेचन के बाद से, कोशिकाएं ईसीएम का निर्माण और पुनर्निर्माण करती हैं, और बदले में इसके द्वारा सख्ती से नियंत्रित होती हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य माउस ईसीएम का विश्लेषण और मानचित्र बनाने का एक तरीका खोलना है, क्योंकि चूहे स्तनधारी पैथोफिजियोलॉजी में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले मॉडल जीव हैं।
इस विधि का विकास मेटास्टेसिस से जुड़े देशी ईसीएम 2 को चिह्नित करने और अलग करने की आवश्यकता से प्रेरित था। चूंकि ट्यूमर में उचित शारीरिक संवहन की कमी होती है और चूहे अपेक्षाकृत छोटे जीव होते हैं, इसलिए माइक्रोसर्जिकल प्रक्रियाओं को महाधमनी को प्रतिगामी रूप से कैथेटराइज़ करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि ट्यूमर (जैसे, फुफ्फुसीय नसों) के लिए अग्रणी प्रमुख पोत के परिसंचरण को अलग करना, इस प्रकार अभिकर्मक प्रवाह पर ध्यान केंद्रित करना और ट्यूमर डीसेल्युलराइजेशन की अनुमति देना। यह विधि एक संरक्षित संरचना 2 के साथ ईसीएम मचानों का उत्पादन करती है जिसे इम्यूनोस्टेन और इमेज किया जा सकता है, जिससे सबमाइक्रोन विस्तार में ईसीएम संरचना मैपिंग की अनुमति मिलती है। इस प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए, सर्जिकल और माइक्रोसर्जिकल कौशल (विच्छेदन, माइक्रोस्यूटरिंग और कैथीटेराइजेशन) प्राप्त करना आवश्यक है जो इसके उपयोग के लिए एक संभावित सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। हमारे ज्ञान के लिए, यह विधि देशी ईसीएम संरचना इमेजिंग विश्लेषण 2,3 के लिए अत्याधुनिक का प्रतिनिधित्व करती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

हम यहां माउस दिल और फेफड़ों के लिए एक डीसेल्युलराइजेशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह संरचनात्मक ईसीएम scaffolds है कि ईसीएम टोपोलॉजी और संरचना का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का उत्पादन करता है. यह एक माइक्रोसर्जिकल प्रक्रिया पर आधारित है जिसे एक euthanized माउस के श्वासनली और महाधमनी को कैथेटराइज़ करने के लिए डिज़ाइन किया गया है ताकि दिल और फेफड़ों को डीसेल्युलराइज़िंग एजेंटों के साथ परफ्यूज किया जा सके। Decellularized cardiopulmonary परिसर बाद में संरचनात्मक ईसीएम प्रोटीन के स्थान को प्रकट करने के लिए immunostained किया जा सकता है। पूरी प्रक्रिया को 4 दिनों में पूरा किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप ईसीएम scaffolds आयामी विकृतियों से मुक्त हैं. कोशिकाओं की अनुपस्थिति 3 डी में सबमाइक्रोन रिज़ॉल्यूशन के नीचे ईसीएम संरचनाओं की संरचनात्मक परीक्षा को सक्षम बनाती है। इस प्रोटोकॉल को 4 सप्ताह के रूप में छोटे चूहों से स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतक पर लागू किया जा सकता है, जिसमें फाइब्रोसिस और कैंसर के माउस मॉडल शामिल हैं, कार्डियोपल्मोनरी रोग से जुड़े ईसीएम रीमॉडलिंग को निर्धारित करने का रास्ता खोलते हैं।

कार्डियोपल्मोनरी डिसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक पूरा करने के बाद, हृदय और फेफड़े, साथ ही साथ महाधमनी चाप जैसे अनुलग्नक ऊतक, कोशिकाओं से मुक्त हो जाएंगे। Decellularization हेमेटोक्?...

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Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चूहों के दिल और फेफड़ों को डीसेलुलराइज करना है। परिणामी बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) scaffolds immunostained किया जा सकता है और उनके घटकों के स्थान और टोपोलॉजी नक्शा करने के लिए imaged.

मुरीन कार्डियोपल्मोनरी कॉम्प्लेक्स का डीसेलुलराइजेशन

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

यह प्रोटोकॉल बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स का प्रवेश द्वार है। यह जटिलता है और इसकी संरचना उप माइक्रोन पैमाने पर नीचे है। तो इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह एक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स प्राप्त करना संभव बनाता है जो इसकी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखता है इस प्रकार जैव रासायनिक और शारीरिक विश्लेषण के लिए रास्ता खोलता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन होगा, Alejandro Mayorca गिलानी, राफेल Reuten और मारिया Rafaeva, वर्तमान में मेरी प्रयोगशाला और क्रिस Madsen में और जो मेरी प्रयोगशाला में था और Lund University में काम जारी रखा. एक बाल क्लिपर के साथ छाती, पेट और euthanized माउस के पीछे शेविंग द्वारा शुरू करो. 70% इथेनॉल के साथ क्षेत्र कीटाणुरहित करें।फिर माउस को एक पॉलीस्टीरीन ट्रे पर पिन करें, इसके चार अंत हिंद अंगों के साथ-साथ इसके सिर और पूंछ का विस्तार करें। इसे माइक्रोसर्जरी माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। मेयो सीधे पैटर्न कैंची का उपयोग करते हुए, एक त्वचीय चीरा बनाएं जो उप-मैंडिबुलर क्षेत्र से निचले पेट तक चल रहा है और वक्षीय दीवार और पेरिटोनियम को उजागर करने के लिए चमड़े के नीचे विच्छेदन करता है।फिर छाती की दीवार के दोनों किनारों पर छठे इंटरकोस्टल स्पेस के साथ पेक्टोरलिस मेजर और पेक्टोरलिस मामूली मांसपेशियों को काटने के लिए माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करें। सीधे पैटर्न कैंची के साथ पिछले चीरों के साथ उरोस्थि को काटें। फिर उरोस्थि को उसकी लंबी धुरी के साथ काटकर एक स्टरनोटॉमी को पूरा करें।ऊपर उठाएं और पिन, कार्डियोपल्मोनरी कॉम्प्लेक्स को उजागर करने के लिए वक्ष यी दीवार के दोनों किनारों। थाइमस और आसपास के वसा ऊतक को नाजुक रूप से उनके अनुलग्नकों से खींचकर एक्साइज करने के लिए गोल इत्तला दी गई माइक्रो संदंश का उपयोग करें। और माइक्रो कैंची के साथ अन्नप्रणाली काटें।ब्राकियोसेफेलिक नसों और ब्रैकियोसेफेलिक धमनी को तेज सूक्ष्म संदंश के साथ अलग करें। फिर बाएं आम कैरोटिड और बाएं सबक्लेवियन धमनियों को अंतर्निहित ऊतक से अलग करें ताकि बंधाव और कैटराइजेशन की सुविधा हो सके। एक microneedle धारक और तेज माइक्रो संदंश और एक नौ ओह टांका का उपयोग करने के लिए brachiocephalic छोड़ दिया आम कैरोटिड और छोड़ दिया subclavian धमनियों के उद्भव के ऊपर टांके जगह, brachiocephalic नसों cauterize.माइक्रो कैंची का उपयोग करके, स्नायुबंधन को विभाजित करके एक प्रवेश द्वार खोलें। श्वासनली में एक 27 गेज कैथेटर का परिचय दें और ब्रोन्ची में श्वासनली की शाखाओं तक नाजुक रूप से धक्का दें, ब्रोन्ची को बाधित न करने का ध्यान रखें। एक छह ओ टांका का उपयोग करके, कैथेटर को सुरक्षित करने के लिए श्वासनली के चारों ओर तीन टांके लगाएं।12 वीं वक्षीय कशेरुका की ऊंचाई पर माउस को अनुभाग करें, अवरोही महाधमनी रीढ़ की हड्डी के लिए पूर्वकाल में चलती है और रीढ़ की हड्डी के साथ यहां विभाजित की जानी चाहिए। प्रतिगामी रूप से महाधमनी कैथेटराइज़ करें और कैथेटर को तब तक धक्का दें जब तक कि यह महाधमनी चाप तक नहीं पहुंच जाता। एक टांका का उपयोग करते हुए, महाधमनी के चारों ओर चार टांके लगाएं, जो कैथेटर टिप के नीचे पांच मिलीमीटर से शुरू होते हैं।सिलिकॉन टयूबिंग और कम connectors का उपयोग कर एक पंप प्रणाली के लिए माउस कनेक्ट करें। 15 मिनट के लिए प्रति मिनट 200 माइक्रोलीटर पर विआयनीकृत पानी के साथ perfuse। फिर परफ्यूजन एजेंट को 0.5% डीओसी में बदलें, विआयनीकृत पानी में पतला हो जाता है और रात भर में फैल जाता है।अगले दिन, विआयनीकृत पानी में पतला 0.1% एसडीएस के लिए परफ्यूजन एजेंट को बदलें, और आठ घंटे के लिए perfuse करें। फिर SDS और DOC को धोने के लिए 24 घंटे के लिए विआयनीकृत पानी के साथ perfuse करें। वक्ष के लिए अपने अनुलग्नकों को विभाजित करके decellularized दिल और फेफड़ों को उच्छेदित करें।ऊतक को चार डिग्री सेल्सियस पर 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.3 माइक्रोमोलर सोडियम एज़ाइड के साथ विआयनीकृत पानी में एक बाँझ क्रायो ट्यूब में स्टोर करें। इम्यूनो स्टेनिंग करने के लिए, नमूने को एक क्रायो ट्यूब में इनक्यूबेट करके अवरुद्ध करें जिसमें 6% गधा सीरम और 3% बीएसए रात भर होता है। फिर 24 घंटे के लिए पीबीएस में 3% गधा सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद प्रति धोने के लिए एक घंटे के लिए PBST में नमूना पांच बार धोएं। 24 घंटे के लिए पीबीएस में 3% गधा सीरम में फ्लोरोसेंट रूप से संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ नमूने को इनक्यूबेट करें। फिर पीबीएसटी में धोने को दोहराएं।आयनित पानी जोड़ें और नमूने को सीधे प्रकाश से दूर चार डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें। नमूने की छवि के लिए, इसे एक ग्लास बॉटम डिश में रखें और इसे भंडारण समाधान की दो बूंदों के साथ आर्द्र करें। उद्देश्य सेट करें और प्रतिदीप्ति प्रकाश का उपयोग करके नमूने का निरीक्षण करें।कंप्यूटर नियंत्रण पर स्विच करें, लेजर चालू करें और लेजर तीव्रता, पिनहोल एपर्चर, डिटेक्टरों तरंग दैर्ध्य, लाभ, संकल्प और ज़ूम को समायोजित करें। Z स्टैक के लिए संख्या और चरण आकार सेट करें, फिर अधिग्रहण शुरू करें। एक euthanized माउस से एक फेफड़े के लोब आबकारी और यह एक 10 से 10 द्वारा पांच मिलीमीटर क्रायो मोल्ड में जगह.इसे ओसीटी यौगिक के लगभग 500 मील माइक्रोलीटर के साथ कवर करें और इसे सूखी बर्फ पर फ्रीज करें। उस तापमान पर नमूने को बनाए रखें। एक संसाधित माउस से एक decellularized फेफड़े के लोब उत्पाद शुल्क, यह सबसे बड़ी सतह क्षेत्र के साथ एक क्रायो मोल्ड में जगह नीचे और OCT यौगिक के साथ इसे कवर.सूखी बर्फ पर नमूने को फ्रीज करें और इसे उस तापमान पर तब तक बनाए रखें जब तक कि अन्यथा आवश्यक न हो। नमूने को कम से कम 12 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर पांच माइक्रोमीटर वर्गों में जमे हुए ऊतक ब्लॉकों को विभाजित करने के लिए एक क्रायोस्टेट का उपयोग करें।और चिपकने वाला ग्लास स्लाइड पर वर्गों जगह. स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर स्थानांतरित करें जब तक कि हवा सूख न जाए। संक्षेप में पीबीएस में स्लाइड्स को विसर्जित करें, इसके बाद 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड।पीबीएस में एक बार धोएं, फिर प्रति धोने के लिए पांच मिनट के लिए आसुत पानी में दो बार धोएं। 10 मिनट के लिए मायर के हेमेटोक्सिलिन समाधान में स्लाइड को विसर्जित करें। इसके बाद, 10 मिनट के लिए आसुत पानी चलाने के तहत एक Copeland जार में स्लाइड धोलें और सात मिनट के लिए eosin समाधान में विसर्जित।जाइलीन में कई बार डुबकी लगाएं। DPX बढ़ते माध्यम की कुछ बूँदें लागू करें और एक ग्लास कवर पर्ची जगह. स्लाइड्स को एक रासायनिक हुड के नीचे रात भर सूखने के लिए छोड़ दें, फिर उन्हें स्लाइड स्कैनर में स्कैन करें।प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक पूरा करने के बाद, हृदय और फेफड़े और एनएक्स ऊतक कोशिकाओं से मुक्त हो जाएंगे। Decellularization ईसीएम scaffolds के hematoxylin eosin धुंधला द्वारा मान्य किया जा सकता है. scaffolds ताजा अंगों के आयामों को बनाए रखने और इसकी insoliable ईसीएम संरचना बरकरार है.ईसीएम scaffolds पारगम्यता और प्रकाश penetrability में वृद्धि हुई से पता चला. एक motorized माइक्रोस्कोप चरण के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए उप माइक्रोन संकल्प पर पूरे माउंट नमूनों के तीन आयामी टाइल इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. पूर्ण समान decellurization प्राप्त करने के लिए ब्याज के अंगों की ओर प्रवाह से बचना आवश्यक है।जहाजों के माइक्रोसर्जिकल विच्छेदन और बंधाव प्रभावी होना चाहिए। और एक ही समय में देशी वीसीएम संरचना को बनाए रखने के लिए लक्ष्य ऊतकों का सम्मान करें। इस प्रक्रिया के बाद, scaffolds संरचनात्मक ईसीएम प्रोटीन के लिए समृद्ध किया जाएगा और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री या ऊतक इंजीनियरिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।यह तकनीक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के उच्च रिज़ॉल्यूशन मैपिंग का मार्ग प्रशस्त करती है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

थकान के एक माउस मॉडल परिधीय विकिरण से प्रेरित

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

उत्पादन और कोशिका चक्र के अलगाव-जटिल Karyotypes के साथ कोशिकाओं को गिरफ्तार किया

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

एक Bioluminescent और फ्लोरोसेंट Orthotopic Syngeneic Murine मॉडल एण्ड्रोजन के आश्रित और बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

जीन परिवर्तन के लिए Murine प्रोस्टेट के लिए CRISPR गाइड के वायरस डिलिवरी

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

प्राथमिक मूत्र मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की तीव्र पीढ़ी

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

इस्कीमिया रिपरफ्यूजन चोट की स्थापना में मेटास्टैटिक लिवर ट्यूमर के Murine मॉडल

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर Murine सिर और गर्दन कैंसर सेल लाइन के विट्रो स्थापना में एक Adeno-एसोसिएटेड वायरस-Cas9 प्रणाली का उपयोग कर

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

कैंसर रोगियों के रक्त प्लाज्मा नमूनों में सेल मुक्त डीएनए का पता लगाना

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी के माध्यम से मुराइन कोरॉयड में मेलेनोमा का आरोपण और मूल्यांकन

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करके ट्रांसमाइटोकॉन्ड्रियल साइब्रिड पीढ़ी

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...