Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
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私たちは、イヴァナ・ノバク教授とニン・メイ・クリステンセン博士(コペンハーゲン大学高度バイオイメージングセンター)に感謝します。この研究は、欧州研究評議会(ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN)によって支援されました。AEM-G、OW、RR、および JTE);ルンドベック財団(R286-2018-621;R286-621)の博士課程のフェローシップMR);スウェーデン研究評議会 (2017-03389;CDM);スウェーデン癌学会, がんフォンデン (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, そして190007;CDM);ドイツ癌援助(ドイツ・クレブシルフェ;RR);デンマーク癌学会 (R204-A12454;RR)。

ここに含まれるすべての手順は、コペンハーゲン大学の実験医学を規制する倫理委員会によって審査され、承認されており、デンマークとヨーロッパの法律に同意しています。このプロトコルを実証するために、8-12週齢の雌BALB/cJマウスと11週齢のMMTV-PyMT雌マウスを使用しました。
注:脱細胞化されたECM足場の細菌汚染を避けることは、最良のイメージング結果を与え、長...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

組織撹拌に基づく脱細胞化技術はECM構造を変化させ、ECM構造解析4に不適当にする。輸液脱細胞化は、気管の大器官のような解剖学的経路を用いて、毛細血管床、または末期のアルベオリに到達することを可能にし、器官全体の脱細胞化剤の送達を促進する。ジウテリオニック、アニオン性、非イオン性洗剤を使用して組織を脱細胞化すると報告されています</s...

ECMは、タンパク質とグリカンで構成された3次元ネットワークであり、多細胞生物のすべての細胞を収容し、臓器に形状を与え、生涯を通じて細胞の挙動を調節します1。卵の受精から、細胞はECMを構築し、改造し、順番に厳密に制御されます。このプロトコルの目的は、マウスが哺乳類の病態生理学で最も使用されるモデル生物であるため、マウスECMを分析し、マッピングする方法を開くものです。
この方法の開発は、転移関連のネイティブECM2を特徴付け、分離する必要性によって推進されました。腫瘍は適切な解剖学的血管化を欠き、マウスは比較的小さな生物であるため、大動脈を逆行させるため、大動脈を逆行させるため、腫瘍につながる主要な血管(例えば肺静脈)の循環を単離し、試薬の流れを集中させ、腫瘍脱細胞化を可能にするマイクロ外科的処置を行った。この方法は、免疫染色および画像化することができる保存構造2を有するECM足場を生成し、サブミクロンの詳細でECM構造マッピングを可能にする。このプロトコルを実行するには、その使用に潜在的な制限を表す可能性のある外科的および微小外科的スキル(解剖、顕微鏡およびカテーテル化)を習得する必要があります。我々の知る限りでは、この方法は、ネイティブECM構造イメージング解析2,3の最先端を表しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

ここでは、マウスの心臓と肺の脱細胞化プロトコルを紹介します。それはECMのトポロジーおよび組成を分析するために使用することができる構造ECM足場を作り出す。これは、心と肺を脱細胞化剤で浸透させるために安楽死マウスの気管および大殿をカテーテルするように設計された微小外科的処置に基づいています。脱細胞化された心肺複合体は、その後、構造ECMタンパク質の位置を明らかにするために免疫染色することができる。全体の手順は、4日で完了することができます。
このプロトコルから生じる ECM スキャフォールドは、寸法の歪みのないものです。細胞の不在により、3Dでのサブミクロン分解能までECM構造の構造検査が可能になります。このプロトコルは、線維症および癌のマウスモデルを含む、生後4週の若いマウスから健康で病気の組織に適用することができ、心肺疾患に関連するECMリモデリングを決定する方法を開く。

心肺脱細胞化 プロトコルを正常に完了した後、心臓と肺、ならびに大動脈弧のような別館組織は、細胞から解放される。脱細胞化は、天然組織と比較して核の除去を示すECM足場のヘマトキシリン-エオシン染色(図1)によって検証することができる。これらの足場は新鮮な器官の寸法を保持し、不溶性ECM構造はそのまま...

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Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

このプロトコルは、マウスの心臓と肺の細胞化を解除することを目的としています。得られた細胞外マトリックス(ECM)足場は、免疫染色され、それらの成分の位置およびトポロジーをマッピングするために画像化することができる。

マウス心肺複合体の脱細胞化

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

このプロトコルは、細胞外マトリックスへのゲートウェイです。それは複雑で、その構造はサブミクロンスケールまでです。したがって、この方法の主な利点は、その構造的完全性を保持する細胞外マトリックスを得ることを可能にし、生化学的および解剖学的分析への道を開くことである。手順を実証します, アレハンドロ・マヨルカ・ギラニ, ラファエル・ロイテンとマリア・ラファエバ, 現在私の研究室とクリス・マドセンにあり、私の研究室にいて、ルンド大学で仕事を続けました.まず、胸郭、腹部、安楽死マウスの背中をヘアクリッパーで剃ります。70%エタノールで除菌します。その後、マウスをポリスチレントレイに固定し、4つの端の後肢と頭と尾を伸ばします。マイクロサージャスト顕微鏡の下に置きます。マヨストレートパターンはさみを使用して、下顎領域から下腹部に流れる皮切開を行い、胸壁と腹膜を露出させるために皮下に解剖する。その後、微小手術ハサミを使用して、胸部壁の両側の6番目の肋間空間に沿って小胸筋と小胸筋を切断する。前の切開に沿って胸骨をまっすぐなパターンはさみで切ります。その後、長い軸に沿って胸骨を切断することによって、ステロトミーを完了します。上昇し、ピン, 胸部壁の両側は、心肺複合体を露出させます.丸い先端のマイクロ鉗子を使用して、胸腺と周囲の脂肪組織を繊細に引き離すことによって脂肪組織を切除します。そして、マイクロハサミで食道をカットします。鋭利なマイクロ鉗子で腕頭静脈と腕頭筋を分離する。次に、左共通の頸動脈と左鎖骨下動脈を下層組織から分離し、結紮および焼灼を促進する。マイクロニードルホルダーと鋭利なマイクロ鉗子と9つの縫合糸を使用して、腕頭蓋左一般的な頸動脈および左鎖骨下動脈の出現の上にステッチを配置し、腕頭蓋静脈を焼灼する。マイクロハサミを使用して、靭帯を切開して入り口を開きます。気管に27ゲージのカテーテルを導入し、気管支が気管支に分岐するまで繊細に押し込み、気管支を乱さないのに注意してください。6つのO縫合を使用して、気管の周りに3つのステッチを置き、カテーテルを固定します。12番目の胸椎の高さでマウスを切り離すと、下降する大動脈は脊椎に対して前方向に走り、脊椎と一緒にここで切り離す必要があります。逆行的に大動脈をカテーテルし、大動脈弧に到達するまでカテーテルを押す。縫合線を使用して、カテーテル先端の下5ミリメートルから始まる大オルタの周りに4つのステッチを置きます。シリコンチューブと下部コネクタを使用して、マウスをポンプシステムに接続します。1分間に200マイクロリットルで脱イオン水を15分間浸透させます。その後、灌流剤を0.5%DOCに変え、脱イオン水で希釈し、一晩浸透する。翌日、灌流剤を脱イオン水で希釈した0.1%SDSに変更し、8時間パーフューズします。その後、脱イオン水を24時間浸透させ、SDSとDOCを洗い流し、脱細胞化された心臓と肺を胸郭に分けて切除します。滅菌性のクライオチューブに、1%ペニシリンストレプトマイシンと0.3ミクロモルナトリウムアジ化体を摂氏4度で除解水で保存します。免疫染色を行う場合は、サンプルを6%ロバ血清と3%BSAを含むクライオチューブに一晩インキュベートしてブロックします。その後、PBSで3%ロバ血清中の一次抗体で24時間インキュベートする。インキュベーション後、PBSTで1回1時間、サンプルを5回洗浄します。PBSで蛍光結合二次抗体を3%ロバ血清で24時間インキュベートします。その後、PBSTでの使用を繰り返します。イオン化水を加え、直接光から4°Cの角度でサンプルを保存します。サンプルを画像化するには、ガラス底皿に入れ、2つの液滴で保存液を加湿します。目的を設定し、蛍光灯を用いてサンプルを検査します。コンピュータ制御に切り替え、レーザーをオンにし、レーザー強度、ピンホール開口、検出器の波長、ゲイン、解像度、ズームを調整します。Z スタックの数とステップ サイズを設定し、取得を開始します。安楽死させたマウスから1つの肺葉を物品切りし、10%10で5ミリメートルのクライオ型に入れます。約500マイルのOCT化合物で覆い、ドライアイスで凍らせます。その温度でサンプルを維持します。処理されたマウスから1つの脱細胞化された肺葉を物品物化し、最大の表面積を下にしたクライオ型に入れ、OCT化合物で覆います。乾燥した氷の上にサンプルを凍結し、必要な場合があるまでその温度でそれを維持します。サンプルは、少なくとも12週間保存することができます。凍結組織ブロックをマイナス20°Cの5マイクロメートルセクションに切り離すためにクライオスタットを使用してください。そして、粘着ガラススライド上のセクションを配置します。スライドを空気乾燥するまで室温に移します。スライドをPBSに簡単に浸し、続いてPBSに4%パラホルムアルデヒドを15分間浸します。PBSで1回洗浄し、その後、1回の洗浄につき5分間蒸留水で2回洗浄します。スライドをマイヤーのヘマトキシリン溶液に10分間浸します。次に、蒸留水を流しているコープランドの瓶でスライドを10分間洗い、エオシン溶液に7分間浸します。キシレンに数回浸します。DPX取付媒体を数滴塗布し、ガラスカバースリップを入れます。スライドをそのままにして化学フードの下で一晩乾燥させ、スライドスキャナでスキャンします。プロトコルを正常に完了した後、心臓と肺とNX組織は細胞から解放されます。脱細胞化は、ECM足場のヘマトキシリンエオシン染色によって検証することができる。足場は新鮮な器官の寸法を保持し、その不柔軟なECM構造はそのままである。ECM足場は透過性および軽い浸透性を増加した。電動顕微鏡ステージでこのプロトコルを使用することで、サブミクロン分解能でマウントサンプル全体の3次元タイルイメージングが可能になります。完全な均一な脱細胞化を達成するためには、目的の器官に向かって流れを避ける必要があります。微小外科的解剖および血管の結紮は有効でなければならない。同時に、ネイティブVCM構造を維持するためにターゲット組織を尊重します。この手順に従って、足場は構造ECMタンパク質のために濃縮され、質量分析または組織工学に使用することができます。この技術は、細胞外マトリックスの高解像度マッピングへの道を開きます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

周辺照射による疲労のマウスモデル

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

世代と複雑な染色体と細胞周期逮捕細胞の分離

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

ウイルスの遺伝子改変マウスの前立腺に CRISPR ガイドの配信

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

原発性マウスメラノサイトと線維芽細胞培養の急速な生成

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

虚血多灌流損傷の設定における転移性肝腫瘍のマウスモデル

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

光干渉断層撮影 による マウス脈絡膜への黒色腫の移植と評価

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...