Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

우리는 현미경 접근을 제공하기 위한 이바나 노박 교수와 Nynne Meyn Christensen 박사(코펜하겐 대학)에게 감사드립니다. 이 작품은 유럽 연구 위원회 (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN)에 의해 지원되었다; AEM-G, OW, RR 및 JTE); 룬드벡 재단(R286-2018-621) 박사 과정 펠로우십; MR; 스웨덴 연구 위원회 (2017-03389; CDM); 스웨덴 암 학회, 암폰덴 (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, 및 190007; CDM); 독일 암 원조 (도이치 크렙실페; RR); 덴마크 암 학회 (R204-A12454; RR).

여기에 포함 된 모든 절차는 코펜하겐 대학의 실험 의학을 규제하는 윤리위원회에 의해 검토되고 승인되었으며 덴마크 및 유럽 법률에 동의합니다. 이 프로토콜을 보여주기 위해, 우리는 나이의 8-12 주의 암컷 BALB/cJ 마우스및 11주의 MMTV-PyMT 여성 마우스를 사용했습니다.
참고: 탈세포화된 ECM 스캐폴드의 세균 오염을 피하면 최고의 이미징 결과를 제공하고 장기적인 샘플 저장?...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

조직 동요에 기초한 탈세포화 기술은 ECM 구조를 변경하여 ECM 구조 분석에 적합하지 않습니다4. 관류 탈세포화는 기관의 대자와 같은 해부학 경로를 사용하여 모세관 침대 또는 말단 폐포에 도달 할 수 있으며 장기 전체에 세포 탈세포화제의 전달을 용이하게합니다. 조직 탈세포화를 위한 zwitterionic, 음이온 및 비이온 세제의 사용은 보고되지만<sup class="x...

ECM은 다세포 유기체의 모든 세포를 수용하는 단백질과 글리칸으로 만든 3차원 네트워크로, 장기에게 모양과 세포 거동을 평생 동안 조절합니다1. 계란 수정에서, 세포는 ECM을 구축하고 리모델링하고, 차례로 엄격하게 그것에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜의 목적은 마우스가 포유류 병리학학에서 가장 많이 사용되는 모델 유기체이기 때문에 마우스 ECM을 분석하고 매핑하는 방법을 여는 것이다.
이 방법의 개발은 전이 연관된 네이티브 ECM2의 특성화 및 분리의 필요성에 의해 주도되었다. 종양이 적당한 해부학 혈관화가 부족하고 마우스는 상대적으로 작은 유기체이기 때문에, 미세 외과 적 절차는 종양으로 이어지는 주요 혈관의 순환을 분리하면서 대동맥을 역행하도록 설계되었으며,이에 따라 시약 흐름에 초점을 맞추고 종양 탈세포화를 허용합니다. 이 방법은 면역 스테인드 및 이미지화 할 수있는 보존 된 구조2를 가진 ECM 스캐폴드를 생성하여 서브미칸 세부 사항으로 ECM 구조 매핑을 허용합니다. 이 프로토콜을 수행하기 위해, 그것의 사용에 잠재적인 한계를 나타낼 수 있는 외과 및 미세 수술 기술 (해부, 미세 주입 및 카테터화)를 취득할 필요가 있습니다. 우리의 지식에, 이 방법은 네이티브 ECM 구조 이미징 분석을 위한 최첨단을 나타냅니다2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

우리는 여기에 마우스 심장과 폐에 대한 탈세포화 프로토콜을 제시합니다. ECM 토폴로지 및 컴포지션을 분석하는 데 사용할 수 있는 구조적 ECM 스캐폴드를 생성합니다. 그것은 탈세포 에이전트로 심혼 과 폐를 퍼퓨퓨어하기 위하여 안락사 마우스의 기관 및 대오르타를 카테터로 케이터터로 디자인된 미세 외과 절차를 기반으로 합니다. 탈세포화된 심폐 복합체는 구조적인 ECM 단백질의 위치를 밝히기 위하여 그 후에 면역염색될 수 있습니다. 전체 절차는 4 일 이내에 완료 할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 발생하는 ECM 스캐폴드는 치수 왜곡이 없습니다. 세포의 부재는 3D에서 서브 미칸 해상도에 ECM 구조의 구조적 검사를 가능하게한다. 이 프로토콜은 섬유증과 암의 마우스 모델을 포함하여 4 주 된 어린 쥐로부터 건강하고 병에 걸린 조직에 적용 될 수 있으며, 심폐 질환과 관련된 ECM 리모델링을 결정하는 방법을 열어.

심폐 탈세포화 프로토콜을 성공적으로 완료한 후, 대동맥 아크와 같은 부속 조직뿐만 아니라 심장과 폐는 세포가 없습니다. 탈세포화는 ECM 스캐폴드의 헤마톡시린-에오신 염색(도 1)에 의해 검증될 수 있으며, 이는 네이티브 조직과 비교하여 핵의 제거를 보여주는 것이다. 이 비계는 신선한 장기의 치수를 유지하고 그것의 용해할 수 ?...

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Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

이 프로토콜은 마우스의 심장과 폐를 탈세포화하는 것을 목표로합니다. 생성된 세포외 매트릭스(ECM) 스캐폴드는 면역염색및 이미지화되어 구성요소의 위치와 토폴로지를 매핑할 수 있다.

뮤린 심폐 복합체의 탈세포화

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

이 프로토콜은 세포외 행렬에 대한 게이트웨이입니다. 그것은 복잡성과 하위 미크로네 규모까지의 구조입니다. 따라서 이 방법의 주요 장점은 구조적 무결성을 유지하는 세포외 매트릭스를 얻을 수 있게 하여 생화학 및 해부학 적 분석의 길을 열어준다는 것입니다.절차를 시연하는 것은 알레한드로 마요르카 길라니, 라파엘 루텐, 마리아 라파에바, 현재 내 실험실과 크리스 매드슨에 있었고 누가 내 실험실에 있었고 룬드 대학에서 작업을 계속했다. 모발 클리퍼로 안락사 마우스의 흉부, 복부 및 뒷면을 면도하여 시작합니다. 70%에탄올로 이 지역을 소독합니다.그런 다음 마우스를 폴리스티렌 트레이에 고정하여 네 개의 끝 뒷다리와 머리와 꼬리를 확장합니다. 미세 수술 현미경 아래에 놓습니다. 마요 직선 패턴 가위를 사용하여, 하부 부위에서 하복부로 의한 배분 절개를 하고 흉부 벽과 복막을 노출하도록 피하한다.그런 다음 흉부 벽의 양쪽에 있는 여섯 번째 늑간 공간을 따라 가슴 경 전공을 절단하고 가슴 경 경미한 근육을 잘라 미세 수술 가위를 사용합니다. 직선 패턴 가위로 이전 절개를 따라 흉골을 자른다. 그런 다음 긴 축을 따라 흉골을 절단하여 스터노절제술을 완료합니다.고양및 핀, 흉부 벽의 양쪽은 심폐 복합체를 노출합니다. 둥근 기울어진 마이크로 포셉을 사용하여 흉선과 주변 지방 조직을 섬세하게 잡아 당겨 서 부착물을 제거합니다. 그리고 마이크로 가위로 식도를 잘라냅니다.날카로운 마이크로 집게와 brachiocephalic 동맥을 분리합니다. 그런 다음 왼쪽 공통 경동맥을 분리하고 혈관분해와 소작을 용이하게 하기 위해 기본 조직으로부터 서브클라비아 동맥을 분리합니다. 마이크로니들 홀더와 날카로운 마이크로 집게와 9개의 오 봉합사를 사용하여 브라치오페할릭왼쪽 공통 경동맥과 좌측 서브클라비아동맥의 출현 위에 바늘을 놓고 브라치오페할릭 정맥을 소작한다.마이크로 가위를 사용하여 인대를 단면화하여 입구를 엽니다. 기관지에 27 게이지 카테터를 도입하고 기관지가 기관지에 들어갈 때까지 섬세하게 밀어 내어 기관지를 방해하지 않도록 주의하십시오. 6O 봉합사를 사용하여 카테터를 확보하기 위해 기관 주위에 3 개의 바늘을 놓습니다.12 흉부 척추의 높이에서 마우스를 절제하고, 내림차순 아오르타는 척추에 전방으로 실행하고 척추와 함께 여기에 단면해야합니다. Aorta를 개조하고 대동맥 호에 도달할 때까지 카테터를 밀어 넣습니다. 봉합사를 사용하여 카테터 팁 아래 5밀리미터에서 시작하여 아오르타 주변에 4개의 바늘을 놓습니다.실리콘 튜빙과 낮은 커넥터를 사용하여 마우스를 펌프 시스템에 연결합니다. 분당 200 마이크로리터에서 15분 동안 탈화된 물로 퍼퓨즈합니다. 그런 다음 관류제를 0.5%DOC로 변경하고, 탈이온화된 물에 희석하고 밤새 퍼퓨즈합니다.다음날, 회류제를 탈화된 물에 희석한 0.1%SDS로 변경하고 8시간 동안 퍼퓨즈한다. 그런 다음 SDS와 DOC를 씻어 24 시간 동안 탈화된 물로 퍼퓨징하여 흉부에 부착물을 분리하여 탈세포 된 심장과 폐를 다시 씻어 내보도록 합니다.멸균 저온 튜브에 1%페니실린 연쇄상 구균및 섭씨 4도에 0.3 마이크로몰라 나트륨 아지드를 사용하여 분해된 물에 조직을 저장합니다. 면역 염색을 수행하기 위해, 하룻밤 6 %의 당나귀 혈청과 3 %BSA를 포함하는 냉동 튜브에서 인큐베이팅하여 샘플을 차단합니다. 그런 다음 PBS에서 3%당나귀 혈청에서 24시간 동안 1차 항체로 배양한다.인큐베이션 후 세척당 1시간 동안 PBST에서 샘플을 5회 세척합니다. PBS에서 3%당나귀 혈청에서 형광으로 공주된 이차 항체를 24시간 동안 배양한다. 그런 다음 PBST에서 세서를 반복합니다.이온화된 물을 추가하고 직접 조명에서 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 샘플을 이미지화하려면 유리 바닥 접시에 넣고 두 방울의 저장 액으로 가습하십시오. 목표를 설정하고 형광광을 사용하여 샘플을 검사합니다.컴퓨터 제어로 전환, 레이저를 켜고 레이저 강도, 핀홀 조리개, 검출기 파장, 게인, 해상도 및 줌을 조정합니다. Z 스택의 숫자와 단계 크기를 설정한 다음 인수를 시작합니다. 안락사 된 마우스에서 하나의 폐 엽을 소비하고 5 밀리미터 저온 금형에 의해 10 10 10에 배치합니다.약 500마일의 100마일 마이크로리터의 OCT 화합물로 덮고 드라이 아이스에 얼립니다. 샘플을 해당 온도에서 유지관리합니다. 가공 된 마우스에서 탈세포 폐 엽 하나를 소비하고, 아래로 가장 큰 표면적을 가진 냉동 금형에 배치하고 OCT 화합물로 덮습니다.드라이 아이스에 샘플을 동결하고 그렇지 않으면 필요할 때까지 그 온도에서 유지합니다. 샘플은 적어도 12 주 동안 저장할 수 있습니다. 냉동 조직 블록을 영하 20도의 5마이크로미터 섹션으로 섹션화하려면 저온을 사용하십시오.그리고 접착제 유리 슬라이드에 섹션을 배치합니다. 공기가 건조 될 때까지 슬라이드를 실온으로 옮기십시오. PBS에서 슬라이드를 잠깐 몰입하고 PBS에서 4 %의 파라포름알데히드를 15 분 동안 담가 두십시오.PBS에서 한 번 씻은 다음, 세척당 5분 동안 증류수로 두 번 씻습니다. 마이어의 헤마톡슬린 솔루션에 10분 간 슬라이드를 담그십시오. 다음으로, 10 분 동안 증류수 아래 코플랜드 항아리에 슬라이드를 세척하고 7 분 동안 eosin 용액에 담급.자일렌에 여러 번 찍어. DPX 장착 중간 크기의 몇 방울을 바르고 유리 커버 슬립을 놓습니다. 슬라이드를 화학 후드 아래에서 밤새 건조한 다음 슬라이드 스캐너에서 스캔합니다.프로토콜을 성공적으로 완료한 후 심장과 폐 및 NX 조직은 세포가 없습니다. 탈세포화는 ECM 스캐폴드의 헤마톡시린 에신 염색에 의해 검증될 수 있다. 비계는 신선한 장기의 치수를 유지하고 그 부전적 ECM 구조는 그대로입니다.ECM 스캐폴드는 투과성 및 광 침투성이 증가하는 것으로 나타났다. 전동 현미경 단계와 이 프로토콜을 사용하면 서브 미크론 해상도에서 전체 마운트 샘플의 3차원 타일 이미징을 허용합니다. 완전한 균일 한 탈화를 달성하기 위해 관심기관을 향해 흐름을 피하는 것이 필수적입니다.혈관의 미세 수술 해부 및 결찰이 효과적이어야합니다. 그리고 동시에 네이티브 VCM 구조를 유지하기 위해 대상 조직을 존중한다. 이 절차에 따라, 비계는 구조 적인 ECM 단백질을 위해 풍부하게 될 것이고 질량 분광법 또는 조직 공학을 위해 사용될 수 있습니다.이 기술은 세포외 매트릭스의 고해상도 매핑을 위한 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

주변 방사선 조사에 의해 유도 된 피로의 마우스 모델

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

연구

암 연구학

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

생성 및 복잡 한 Karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

1 차적인 뮤린 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양물의 급속한 생성

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

허혈 재관류 손상의 설정에서 전이성 간 종양의 뮤린 모델

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

광간섭 단층촬영을 통한 쥐 맥락막의 흑색종 이식 및 평가

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

암 세포주를 이용한 트랜스미토콘드리아 Cybrid 생성

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...