Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
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Agradecemos à Profª Ivana Novak e à Dra. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); bolsa de doutorado da Fundação Lundbeck (R286-2018-621; MR); o Conselho Sueco de Pesquisa (2017-03389; MDL); a Sociedade Sueca de Câncer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; MDL); Ajuda ao câncer alemão (Deutsche Krebshilfe; RR); e a Sociedade Dinamarquesa de Câncer (R204-A12454; RR).

Todos os procedimentos aqui incluídos foram revisados e aprovados pelo comitê de ética que regula a medicina experimental na Universidade de Copenhague e concordam com a legislação dinamarquesa e europeia. Para demonstrar este protocolo, usamos camundongos BALB/cJ fêmeas de 8-12 semanas de idade e um rato fêmea MMTV-PyMT de 11 semanas de idade.
NOTA: Evitar a contaminação bacteriana do andaime ECM descelularizado dá o melhor resultado de imagem e permite o armazenamento de amostras a...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

Técnicas de descelularização baseadas na agitação tecidual alteram a estrutura do ECM, tornando-as inadequadas para análise da estrutura do ECM4. A descelularização da perfusão, utilizando uma rota anatômica como a aorta da traqueia, permite chegar ao leito capilar, ou alvéolo terminal, e facilita a entrega de agentes descelularizantes em todo o órgão. O uso de detergentes zwitterionic, aniônicos e não iônicos para descelularizar tecidos é relatado4,5,6, no entanto, sulfato de dod...

O ECM é uma rede tridimensional feita de proteínas e glicanos que acomoda todas as células em um organismo multicelular, dando aos órgãos sua forma e regulando o comportamento celular ao longo da vida1. A partir da fertilização dos óvulos em diante, as células constroem e remodelam o ECM, e por sua vez são estritamente controladas por ele. O objetivo deste protocolo é abrir uma maneira de analisar e mapear o ECM do rato, já que os camundongos são o organismo modelo mais utilizado na fisiopatologia mamífera.
O desenvolvimento deste método foi impulsionado pela necessidade de caracterizar e isolar o ECM2 nativo associado à metástase. Como os tumores não possuem vascularização anatômica adequada e os camundongos são organismos relativamente pequenos, procedimentos microcirúrgicos foram projetados para cateterizar retrogrademente a aorta, isolando a circulação do vaso principal que leva a um tumor (por exemplo, as veias pulmonares), focando assim o fluxo de reagentes e permitindo a descelularização tumoral. Este método produz andaimes ECM com uma estrutura conservada2 que podem ser imunossuídas e imagens, permitindo o mapeamento da estrutura ECM em detalhes de submicron. Para realizar esse protocolo, é necessário adquirir habilidades cirúrgicas e microcirúrgicas (dissecção, microsutura e cateterismo) que possam representar uma potencial limitação ao seu uso. Para nosso conhecimento, este método representa o estado da arte para análise de imagem de estrutura ecm nativa2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

Apresentamos aqui um protocolo de descelularização para coração e pulmões de rato. Produz andaimes estruturais de ECM que podem ser usados para analisar topologia e composição de ECM. Baseia-se em um procedimento microcirúrgico projetado para cateterizar a traqueia e a aorta de um rato eutanizado para perfundir o coração e os pulmões com agentes descelularizantes. O complexo cardiopulmonar descelularizado pode, posteriormente, ser imunossuperado para revelar a localização de proteínas estruturais de ECM. Todo o procedimento pode ser concluído em 4 dias.
Os andaimes ECM resultantes deste protocolo estão livres de distorções dimensionais. A ausência de células permite o exame estrutural das estruturas de ECM até a resolução de submicron em 3D. Este protocolo pode ser aplicado a tecidos saudáveis e doentes de camundongos com até 4 semanas de idade, incluindo modelos de camundongos de fibrose e câncer, abrindo caminho para determinar a remodelação do ECM associada à doença cardiopulmonar.

Descelularização cardiopulmonar Após a conclusão do protocolo com sucesso, o coração e os pulmões, bem como o tecido anexo, como o arco aórtico, estarão livres de células. A descelularização pode ser validada pela coloração de hematoxilina-eosina (Figura 1) dos andaimes ECM mostrando a remoção dos núcleos comparando com o tecido nativo. Estes andaimes retêm as dimensões de órgãos frescos e sua estrutura ECM insolúvel ...

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Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Este protocolo visa descelularizar o coração e os pulmões dos ratos. Os andaimes de matriz extracelular resultante (ECM) podem ser imunossuados e imagens para mapear a localização e topologia de seus componentes.

Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Este protocolo é a porta de entrada para a matriz extracelular. É a complexidade e sua estrutura até a escala de sub-micron. Assim, a principal vantagem deste método é que ele possibilita a obtenção de uma matriz extracelular que mantenha sua integridade estrutural, abrindo assim o caminho para a análise bioquímica e anatômica.Demonstrando o procedimento serão, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten e Maria Rafaeva, atualmente em meu laboratório e Chris Madsen e que estava em meu laboratório e continuou o trabalho na Universidade de Lund. Comece raspando o tórax, abdômen e parte de trás do rato eutanizado com um cortador de cabelo. Desinfetar a área com 70% de etanol.Em seguida, fixe o mouse em uma bandeja de poliestireno, estendendo seus quatro membros traseiros finais, bem como sua cabeça e cauda. Coloque-o sob o microscópio de microcirurgia. Usando uma tesoura de padrão reto mayo, faça uma incisão cutânea que vai da região sub mandibular até o abdômen inferior e disseque subcutânea para expor a parede torácica e o peritônio.Em seguida, use uma tesoura microcirúrgica para cortar os músculos peitoralis maiores e peitoral ao longo do sexto espaço intercostal em ambos os lados da parede torácica. Corte o esterno ao longo das incisões anteriores com uma tesoura de padrão reto. Em seguida, complete uma esternotomia cortando o esterno ao longo de seu longo eixo.Elevar e fixar, ambos os lados da parede torácica para expor o complexo cardiopulmonar. Use micro fórceps redondos para extirpor o timo e o tecido adiposo circundante, retirando-os delicadamente de seus acessórios. E corte o esôfago com micro tesoura.Separe as veias braquiocelicas e a artéria braquiocefálica com micro fórceps afiados. Em seguida, separe as artérias subcláusicas comuns e esquerdas esquerdas do tecido subjacente para facilitar a ligadura e a cauterização. Use um suporte de microagulha e micro fórceps afiados e uma sutura de nove oh para colocar pontos acima do surgimento do braquiocefálico esquerdo comum e artérias subclávias esquerdas, cauterizar as veias braquiocefálicas.Usando micro tesoura, abra uma entrada seccionando o ligamento. Introduza um cateter de calibre 27 na traqueia e empurre delicadamente até que a traqueia se esvai nos brônquios, tomando cuidado para não interromper os brônquios. Usando uma sutura de seis O, coloque três pontos ao redor da traqueia para fixar o cateter.Seção o rato na altura da 12ª vértebra torácica, a aorta descendente corre anteriormente para a coluna vertebral e deve ser seccionada aqui junto com a coluna vertebral. Cateterize retrógradamente a Aorta e empurre o cateterismo até atingir o arco aórtico. Usando uma sutura, coloque quatro pontos ao redor da Aorta, começando cinco milímetros abaixo da ponta do cateter.Conecte o mouse a um sistema de bomba usando tubos de silicone e conectores inferiores. Perfum com água desionizada a 200 microliters por minuto durante 15 minutos. Em seguida, mude o agente de perfusão para 0,5% DOC, diluído em água deionizada e perfuuse durante a noite.No dia seguinte, mude o agente de perfusão para 0,1%SDS diluído em água deionizada, e perfuuse por oito horas. Em seguida, perfuse com água deionizada por 24 horas para lavar o SDS e DOC. Ressectar o coração e pulmões descelularizados, seccionando seus anexos ao tórax.Armazene o tecido em um tubo criogênico estéril em água deionizada com estreptomicina de penicilina de 1% e 0,3 azida de sódio micromolar a quatro graus Celsius. Para realizar a coloração imuno, bloqueie a amostra incubando-a em um tubo criogênico contendo 6% de soro de burro e 3% de BSA durante a noite. Em seguida, incubar com anticorpo primário em 3% de soro de burro na PBS por 24 horas.Após a incubação lave a amostra cinco vezes em PBST durante uma hora por lavagem. Incubar a amostra com anticorpo secundário conjugado fluorescente em soro de burro de 3% em PBS por 24 horas. Em seguida, repita as lavagens em PBST.Adicione a água ionizada e armazene a amostra a quatro graus Celsius longe da luz direta. Para imaginar a amostra, coloque-a em um prato de fundo de vidro e umidifice-a com duas gotículas de solução de armazenamento. Defina o objetivo e inspecione a amostra usando luz de fluorescência.Mude para o controle do computador, ligue lasers e ajuste a intensidade do laser, abertura do pinhole, detectores de comprimento de onda, ganho, resolução e zoom. Defina o número e o tamanho do passo para a pilha Z e comece a aquisição. Extirbe um lobo pulmonar de um rato eutanizado e coloque-o em um molde criogeno de 10 por 10 por cinco milímetros.Cubra-o com aproximadamente 500 milhas de microliters de composto OCT e congele-o em gelo seco. Mantenha a amostra a essa temperatura. Extirpo um lobo pulmonar descelularizado de um rato processado, coloque-o em um molde criogeno com a maior área de superfície para baixo e cubra-o com composto OCT.Congele a amostra em gelo seco e mantenha-a a essa temperatura até que seja necessária. A amostra pode ser armazenada por pelo menos 12 semanas. Use um criostat para seção de blocos de tecido congelados em cinco seções de micrômetros a menos 20 graus Celsius.E coloque as seções em lâminas de vidro adesivo. Transfira os slides para a temperatura ambiente até que o ar seque. Mergulhe brevemente os slides em PBS, seguido de 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos.Lave uma vez na PBS, depois duas vezes em água destilada por cinco minutos por lavagem. Mergulhe os slides na solução de hematoxilina de Myer por 10 minutos. Em seguida, lave os slides em um frasco de Copeland sob água destilada por 10 minutos e mergulhe na solução de eosina por sete minutos.Mergulhe em xileno várias vezes. Aplique algumas gotas de meio de montagem DPX e coloque um deslizamento de tampa de vidro. Deixe os slides secarem durante a noite sob um capô químico e depois escaneie-os em um scanner de slides.Depois de completar com sucesso o protocolo, o coração e os pulmões e o tecido NX estarão livres de células. A descelularização pode ser validada pela coloração de eosina hematoxilina dos andaimes ECM. Os andaimes retêm as dimensões de órgãos frescos e sua estrutura ECM insoável está intacta.Os andaimes ECM apresentaram aumento da permeabilidade e penetrabilidade da luz. O uso deste protocolo com um estágio de microscópio motorizado permite imagens tridimensionais de azulejos de amostras de montagem inteiras em resolução de sub-micron. É essencial evitar o fluxo em direção aos órgãos de interesse para alcançar a completa descelurização uniforme.A dissecação microcirúrgica e a ligadura dos vasos devem ser eficazes. E, ao mesmo tempo, respeite os tecidos alvo para manter a estrutura nativa do VCM. Após este procedimento, os andaimes serão enriquecidos para proteínas estruturais de ECM e podem ser usados para espectrometria de massa ou engenharia de tecidos.Esta técnica abre caminho para o mapeamento de alta resolução da matriz extracelular.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Pesquisa do câncer

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Geração e isolamento de células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Entrega de vírus de CRISPR guias de próstata murino para alteração do Gene

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Estabelecimento de uma linha de células de câncer de urina de urina geneticamente modificada usando um sistema adeno associado de vírus-cas9

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantação e Avaliação do Melanoma na Coroide Murina via Tomografia de Coerência Óptica

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...