Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Мы благодарим профессора Ивану Новак и доктора Нинн Майн Кристенсен (Центр усовершенствованной биовизуализации (CAB), Копенгагенский университет) за предоставление доступа к микроскопу. Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR и JTE); стипендия PhD от Фонда Лундбека (R286-2018-621; МР); Шведский исследовательский совет (2017-03389; МЧР); Шведское онкологическое общество, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, и 190007; МЧР); Немецкая онкологическая помощь (Deutsche Krebshilfe; РР); и Датское онкологическое общество (R204-A12454; РР).

Все процедуры, включенные здесь, были рассмотрены и одобрены этическим комитетом, регулирующим экспериментальную медицину в Копенгагенском университете, и согласуются с датским и европейским законодательством. Чтобы продемонстрировать этот протокол, мы использовали самок мышей BALB / ...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

Методы децеллюляризации, основанные на тканевом перемешивании, изменяют структуру ECM, что делает их непригодными для анализа структуры ECM4. Перфузионная децеллюляризация с использованием анатомического пути, такого как аорта трахеи, позволяет достичь капиллярного русла и...

ECM представляет собой трехмерную сеть, состоящую из белков и гликанов, которая вмещает все клетки в многоклеточном организме, придавая органам их форму и регулируя поведение клеток на протяжении всей жизни1. Начиная с оплодотворения яйцеклеток, клетки строят и реконструируют ECM и, в свою очередь, строго контролируются им. Целью этого протокола является открытие способа анализа и картирования ECM мыши, поскольку мыши являются наиболее используемым модельным организмом в патофизиологии млекопитающих.
Развитие этого метода было обусловлено необходимостью охарактеризовать и изолировать связанный с метастазами нативный ECM2. Поскольку опухоли не имеют надлежащей анатомической васкуляризации, а мыши являются относительно небольшими организмами, микрохирургические процедуры были разработаны для ретроградной катетеризации аорты, при этом изолируя кровообращение основного сосуда, ведущего к опухоли (например, легочных вен), тем самым фокусируя поток реагентов и позволяя децеллюляризацию опухоли. Этот метод создает каркасы ECM с сохраненной структурой2, которые могут быть иммуноокрашены и визуализированы, что позволяет отображать структуру ECM в субмикронных деталях. Для выполнения этого протокола необходимо приобрести хирургические и микрохирургические навыки (рассечение, микрозащищение и катетеризация), которые могут представлять собой потенциальное ограничение его использования. Насколько нам известно, этот метод представляет собой современное состояние для анализа нативной структуры ECM2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

Мы представляем здесь протокол децеллюляризации сердца и легких мыши. Он создает структурные каркасы ECM, которые можно использовать для анализа топологии и состава ECM. Он основан на микрохирургической процедуре, предназначенной для катетеризации трахеи и аорты усыпленной мыши для перфузии сердца и легких децеллюляризирующими агентами. Децеллюляризованный сердечно-легочный комплекс впоследствии может быть иммуноокрашен, чтобы выявить расположение структурных белков ECM. Вся процедура может быть завершена за 4 дня.
Каркасы ECM, полученные в результате этого протокола, свободны от размерных искажений. Отсутствие ячеек позволяет проводить структурное исследование структур ECM вплоть до субмикронного разрешения в 3D. Этот протокол может быть применен к здоровым и больным тканям мышей в возрасте от 4 недель, включая мышиные модели фиброза и рака, открывая путь к определению ремоделирования ECM, связанного с сердечно-легочным заболеванием.

Сердечно-легочная децеллюляризация После успешного завершения протокола сердце и легкие, а также аннексированная ткань, такая как дуга аорты, будут свободны от клеток. Децеллюляризация может быть подтверждена окрашиванием гематоксилин-эозином (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Этот протокол направлен на децеллюляризацию сердца и легких мышей. Полученные каркасы внеклеточного матрикса (ECM) могут быть иммуноокрашены и визуализированы для отображения местоположения и топологии их компонентов.

Децеллюляризация мышиного сердечно-легочного комплекса

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Этот протокол является шлюзом к внеклеточному матриксу. Это сложность и его структура вплоть до субмикронного масштаба. Таким образом, ключевым преимуществом этого метода является то, что он позволяет получить внеклеточный матрикс, который сохраняет свою структурную целостность, тем самым открывая путь для биохимического и анатомического анализа.Продемонстрировать процедуру будут Алехандро Майорка Гилани, Рафаэль Ройтен и Мария Рафаева, которые в настоящее время находятся в моей лаборатории, и Крис Мэдсен, который был в моей лаборатории и продолжил работу в Лундском университете. Начните с бритья грудной клетки, брюшка и спины усыпленной мыши с помощью машинки для стрижки волос. Продезинфицируйте участок 70% этанолом.Затем прикрепите мышь к полистирольному лотку, вытянув ее четыре конца задних конечностей, а также голову и хвост. Поместите его под микроскоп микрохирургии. Используя ножницы с прямым рисунком Майо, сделайте кожный разрез, идущий от подчелюстной области до нижней части живота и рассекните подкожно, чтобы обнажить грудную стенку и брюшину.Затем используйте микрохирургические ножницы, чтобы разрезать большую грудную клетку и грудную клетку минорных мышц вдоль шестого межреберного пространства по обеим сторонам грудной стенки. Вырежьте грудину вдоль предыдущих разрезов ножницами с прямым рисунком. Затем завершите стернотомию, разрезав грудину вдоль ее длинной оси.Приподнимите и закрепите обе стороны грудной стенки, чтобы обнажить сердечно-легочный комплекс. Используйте микрощипцы с круглым наконечником, чтобы иссечь тимус и окружающие его жировые ткани, деликатно стягивая их с прикреплений. И разрезать пищевод микроножными ножницами.Отделите брахиоцефальные вены и брахиоцефальную артерию острыми микрощипцами. Затем отделите левую общую сонную и левую подключичную артерии от подлежащей ткани, чтобы облегчить перевязку и прижигание. Используйте держатель микроигл и острые микрощипцы и девятишовный шов, чтобы наложить швы над появлением брахиоцефальной левой общей сонной и левой подключичной артерий, прижечь брахиоцефальные вены.С помощью микроножек откройте вход, разрезав связку. Введите катетер 27 калибра в трахею и деликатно протолкните до тех пор, пока трахея не разветвится в бронхи, заботясь о том, чтобы не нарушить работу бронхов. Используя шов шесть O, наложите три шва вокруг трахеи, чтобы закрепить катетер.Сечение мыши на высоте 12-го грудного позвонка, нисходящая аорта проходит спереди к позвоночнику и должна быть разделена здесь вместе с позвоночником. Ретроградно катетеризирует аорту и толкает катетер до тех пор, пока он не достигнет дуги аорты. Используя шов, наложите четыре шва вокруг аорты, начиная с пяти миллиметров ниже кончика катетера.Подключите мышь к насосной системе с помощью силиконовых трубок и нижних разъемов. Настаивайте на деионизированной воде со скоростью 200 микролитров в минуту в течение 15 минут. Затем замените перфузионное средство на 0,5% DOC, разведенное в деионизированной воде и перфьцирующее на ночь.На следующий день замените перфузионное средство на 0,1% SDS, разведенное в деионизированной воде, и перфьюируйте в течение восьми часов. Затем перфузируйте деионизированной водой в течение 24 часов, чтобы смыть SDS и DOC. Резекция децеллюляризированного сердца и легких путем разрезания его прикреплений к грудной клетке.Храните ткань в стерильной криотрубке в деионизированной воде с 1% пенициллина стрептомицина и 0,3 микромолярного азида натрия при четырех градусах Цельсия. Чтобы выполнить иммуноокрасление, заблокируйте образец, инкубируя его в криотрубке, содержащей 6% ослиной сыворотки и 3% BSA на ночь. Затем инкубируют с первичным антителом в 3% ослиной сыворотке в PBS в течение 24 часов.После инкубации промыть образец пять раз в ПБСТ в течение одного часа за одну промывку. Инкубируйте образец с флуоресцентно конъюгированным вторичным антителом в 3%-ной ослиной сыворотке в PBS в течение 24 часов. Затем повторите промывку в PBST.Добавьте ионизированную воду и храните образец при четырех градусах Цельсия вдали от прямого света. Чтобы получить изображение образца, поместите его в стеклянную нижнюю посуду и увлажните двумя каплями раствора для хранения. Установите цель и осмотрите образец с помощью флуоресцентного света.Переключитесь на компьютерное управление, включите лазеры и отрегулируйте интенсивность лазера, диафрагму точечных отверстий, длину волны детекторов, коэффициент усиления, разрешение и масштабирование. Задайте число и размер шага для стека Z, а затем начните сбор. Вырежьте одну долю легкого из усыпленной мыши и поместите ее в криоформу размером 10 на 10 на пять миллиметров.Накройте его примерно 500-мильными микролитрами соединения OCT и заморозьте на сухом льду. Поддерживайте образец при этой температуре. Иссейте одну децеллюляризированную долю легкого из обработанной мыши, поместите ее в криоформу с наибольшей площадью поверхности вниз и покройте ее соединением OCT.Заморозьте образец на сухом льду и поддерживайте его при этой температуре до тех пор, пока не потребуется иное. Образец может храниться не менее 12 недель. Используйте криостат для разрезания замороженных тканевых блоков на пять микрометровых секций при минус 20 градусах Цельсия.И разместите секции на слайдах из клейкого стекла. Переведите слайды к комнатной температуре до высыхания на воздухе. Кратко опустите слайды в PBS, а затем 4% параформальдегида в PBS в течение 15 минут.Мойте один раз в PBS, затем два раза в дистиллированной воде в течение пяти минут за одну стирку. Погрузите слайды в раствор гематоксилина Майера на 10 минут. Затем промыть горки в банке Коупленда под проточной дистиллированной водой на 10 минут и погрузить в раствор эозина на семь минут.Обмакните в ксилол несколько раз. Нанесите несколько капель монтажного носителя DPX и поместите стеклянную крышку. Оставьте слайды сушиться на ночь под химическим капотом, а затем отсканируйте их в слайд-сканере.После успешного завершения протокола сердце, легкие и ткань NX будут свободны от клеток. Децеллюляризация может быть подтверждена окрашиванием гематоксилиновым эозином каркасов ECM. Каркасы сохраняют размеры свежих органов, а его неустойчивая структура ECM неповреждена.Эшафоты ECM показали повышенную проницаемость и светопроницаемость. Использование этого протокола с моторизованной ступенью микроскопа позволяет получать трехмерную мозаичную визуализацию целых образцов с разрешением ниже микрона. Важно избегать потока к интересующим органам для достижения полной равномерной децеллюризации.Микрохирургическое рассечение и перевязка сосудов должны быть эффективными. И в то же время уважать ткани-мишени для поддержания нативной структуры VCM. После этой процедуры каркасы будут обогащены структурными белками ECM и могут быть использованы для масс-спектрометрии или тканевой инженерии.Этот метод прокладывает путь к картированию внеклеточного матрикса с высоким разрешением.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Мышь Модель усталости, индуцированный Peripheral Облучение

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Поколение и изоляции арестован клеточного цикла клетки с сложных получен

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Биолюминесцентных и флуоресцентный ортотопическая сингенных мышиных модель андроген зависимых и кастрация стойкие рака простаты

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Вирус доставки ТРИФОСФАТЫ руководств для мышиных простаты для изменения гена

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Быстрое поколение первичных культур Мурин Меланоцит и Фибробласт

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Murine Модель метастатических опухолей печени в настройке Ишемия Реперфузия Травмы

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

В vitro Создание генетически инженерии Murine головы и шеи рак овой линии с использованием Адено-ассоциированных Вирус-Cas9 системы

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Обнаружение ДНК без клеток в образцах плазмы крови онкологических больных

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Имплантация и оценка меланомы в сосудистой оболочке мыши с помощью оптической когерентной томографии

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Генерация трансмитохондриальных цибридов с использованием линий раковых клеток

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...