Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
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Agradecemos a la Prof. Ivana Novak y a la Dra. Nynne Meyn Christensen (Centro de Bioimagen Avanzada (CAB), Universidad de Copenhague) por proporcionar acceso al microscopio. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR y JTE); una beca de doctorado de la Fundación Lundbeck (R286-2018-621; MR); el Consejo Sueco de Investigación (2017-03389; MDL); la Sociedad Sueca del Cáncer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj y 190007; MDL); Ayuda alemana contra el cáncer (Deutsche Krebshilfe; RR); y la Sociedad Danesa del Cáncer (R204-A12454; RR).

Todos los procedimientos incluidos aquí han sido revisados y aprobados por el comité ético que regula la medicina experimental en la Universidad de Copenhague y están de acuerdo con la legislación danesa y europea. Para demostrar este protocolo, hemos utilizado ratones hembra BALB/cJ de 8-12 semanas de edad y un ratón hembra MMTV-PyMT de 11 semanas de edad.
NOTA: Evitar la contaminación bacteriana del andamio ECM descelularizado proporciona el mejor resultado de imagen y permite el alma...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

Las técnicas de descelularización basadas en la agitación tisular alteran la estructura de la ECM, haciéndolas inadecuadas para el análisis de la estructura de la ECM4. La descelularización por perfusión, mediante una vía anatómica como la aorta de la tráquea, permite llegar al lecho capilar, o alvéolos terminales, y facilita la entrega de agentes descelularizantes por todo el órgano. Se reporta el uso de detergentes zwitteriónicos, aniónicos y no iónicos para descelularizar el <sup...

La ECM es una red tridimensional formada por proteínas y glicanos que da cabida a todas las células de un organismo multicelular, dando a los órganos su forma y regulando el comportamiento celular a lo largo de la vida1. Desde la fertilización del óvulo en adelante, las células construyen y remodelan el ECM, y a su vez están estrictamente controlados por él. El propósito de este protocolo es abrir una forma de analizar y mapear la ECM de ratón, ya que los ratones son el organismo modelo más utilizado en la fisiopatología de mamíferos.
El desarrollo de este método fue impulsado por la necesidad de caracterizar y aislar ECM2 nativo asociado a metástasis. Como los tumores carecen de vascularización anatómica adecuada y los ratones son organismos relativamente pequeños, se diseñaron procedimientos microquirúrgicos para cateterizar retrógradamente la aorta, al tiempo que aíslan la circulación del vaso principal que conduce a un tumor (por ejemplo, las venas pulmonares), enfocando así el flujo de reactivos y permitiendo la descelularización del tumor. Este método produce andamios ecm con una estructura conservada2 que puede ser inmunoteñida y fotografiada, lo que permite el mapeo de la estructura ECM en detalle submicrónico. Para llevar a cabo este protocolo, es necesario adquirir habilidades quirúrgicas y microquirúrgicas (disección, microsutura y cateterismo) que pueden representar una potencial limitación a su uso. Hasta donde sabemos, este método representa el estado del arte para el análisis de imágenes de estructuras ECM nativas2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

Presentamos aquí un protocolo de descelularización para corazón y pulmones de ratón. Produce andamios estructurales de ECM que se pueden usar para analizar la topología y composición de ECM. Se basa en un procedimiento microquirúrgico diseñado para cateterizar la tráquea y la aorta de un ratón sacrificado para perfundir el corazón y los pulmones con agentes descelularizantes. El complejo cardiopulmonar descelularizado puede ser posteriormente inmunoteñido para revelar la ubicación de las proteínas ECM estructurales. Todo el procedimiento se puede completar en 4 días.
Los andamios ECM resultantes de este protocolo están libres de distorsiones dimensionales. La ausencia de células permite el examen estructural de las estructuras de ECM hasta la resolución submicrónica en 3D. Este protocolo se puede aplicar a tejido sano y enfermo de ratones de tan solo 4 semanas de edad, incluidos modelos de ratón de fibrosis y cáncer, abriendo el camino para determinar la remodelación de ecm asociada con la enfermedad cardiopulmonar.

Descelularización cardiopulmonar Después de completar con éxito el protocolo, el corazón y los pulmones, así como el tejido anexo, como el arco aórtico, estarán libres de células. La descelularización puede ser validada por tinción de hematoxilina-eosina (Figura 1) de los andamios de ECM que muestran la eliminación de los núcleos en comparación con el tejido nativo. Estos andamios conservan las dimensiones de los órganos fres...

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Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Este protocolo tiene como objetivo descelularizar el corazón y los pulmones de los ratones. Los andamios de matriz extracelular (ECM) resultantes pueden ser inmunoteñidos y fotografiados para mapear la ubicación y la topología de sus componentes.

Descelularización del complejo cardiopulmonar murino

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Este protocolo es la puerta de entrada a la matriz extracelular. Su complejidad y su estructura hasta una escala submicrométrica. Por lo tanto, la ventaja clave de este método es que permite obtener una matriz extracelular que conserva su integridad estructural, abriendo así el camino para el análisis bioquímico y anatómico.Demostrando el procedimiento estarán, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten y Maria Rafaeva, actualmente en mi laboratorio y Chris Madsen y quien estuvo en mi laboratorio y continuó el trabajo en la Universidad de Lund. Comience afeitando el tórax, el abdomen y la parte posterior del ratón sacrificado con un cortapelos. Desinfectar la zona con etanol al 70%.Luego fije el ratón a una bandeja de poliestireno, extendiendo sus extremidades traseras de cuatro extremos, así como su cabeza y cola. Colóquelo debajo del microscopio de microcirugía. Usando unas tijeras de patrón recto de Mayo, haga una incisión cutánea que se extienda desde la región submandibular hasta la parte inferior del abdomen y diseccione por vía subcutánea para exponer la pared torácica y el peritoneo.Luego use tijeras microquirúrgicas para cortar los músculos pectoral mayor y pectoral menor a lo largo del sexto espacio intercostal a ambos lados de la pared torácica. Corte el esternón a lo largo de las incisiones anteriores con tijeras de patrón recto. Luego complete una esternotomía cortando el esternón a lo largo de su eje largo.Elevar y fijar, ambos lados de la pared torácica para exponer el complejo cardiopulmonar. Use micro pinzas de punta redonda para extirpar el timo y el tejido adiposo circundante sacándolos delicadamente de sus accesorios. Y cortar el esófago con micro tijeras.Separe las venas braquiocefálicas y la arteria braquiocefálica con micro pinzas afiladas. Luego separe las arterias carótida común izquierda y subclavia izquierda del tejido subyacente para facilitar la ligadura y cauterización. Use un soporte para microagujas y micro pinzas afiladas y una sutura de nueve oh para colocar puntos de sutura por encima de la aparición de la carótida común izquierda braquiocefálica y las arterias subclavias izquierdas, cauterice las venas braquiocefálicas.Usando micro tijeras, abra una entrada seccionando el ligamento. Introduzca un catéter de calibre 27 en la tráquea y empuje delicadamente hasta que la tráquea se ramifique en los bronquios, teniendo cuidado de no interrumpir los bronquios. Usando una sutura de seis O, coloque tres puntos de sutura alrededor de la tráquea para asegurar el catéter.Secciona el ratón a la altura de la 12ª vértebra torácica, la aorta descendente corre hacia arriba de la columna vertebral y debe seccionarse aquí junto con la columna vertebral. Cateterice retrógradamente la aorta y empuje el catéter hasta que llegue al arco aórtico. Usando una sutura, coloque cuatro puntos alrededor de la aorta, comenzando cinco milímetros por debajo de la punta del catéter.Conecte el ratón a un sistema de bomba mediante tubos de silicona y conectores inferiores. Perfundir con agua desionizada a 200 microlitros por minuto durante 15 minutos. Luego cambie el agente de perfusión a 0.5% DOC, diluido en agua desionizada y perfunda durante la noche.Al día siguiente, cambie el agente de perfusión a 0.1% SDS diluido en agua desionizada y perfunda durante ocho horas. Luego perfunda con agua desionizada durante 24 horas para lavar el SDS y el DOC. Reseque el corazón y los pulmones descelularizados seccionando sus uniones al tórax.Almacene el tejido en un tubo criogénico estéril en agua desionizada con estreptomicina de penicilina al 1% y azida de sodio micromolar a cuatro grados centígrados. Para realizar la inmunomantación, bloquee la muestra incubándola en un tubo criogénico que contenga 6% de suero de burro y 3% de BSA durante la noche. Luego incubar con anticuerpo primario en suero de burro al 3% en PBS durante 24 horas.Después de la incubación, lave la muestra cinco veces en PBST durante una hora por lavado. Incubar la muestra con anticuerpos secundarios conjugados fluorescentemente en suero de burro al 3% en PBS durante 24 horas. Luego repita los lavados en PBST.Agregue el agua ionizada y almacene la muestra a cuatro grados centígrados de distancia de la luz directa. Para obtener una imagen de la muestra, colóquela en un plato con fondo de vidrio y humidifíquela con dos gotas de solución de almacenamiento. Establezca el objetivo e inspeccione la muestra con luz de fluorescencia.Cambie al control por computadora, encienda los láseres y ajuste la intensidad del láser, la apertura estenopeica, la longitud de onda de los detectores, la ganancia, la resolución y el zoom. Establezca el número y el tamaño del paso para la pila Z y, a continuación, comience la adquisición. Extirpe un lóbulo pulmonar de un ratón sacrificado y colóquelo en un molde criogénico de 10 por 10 por cinco milímetros.Cúbralo con aproximadamente 500 millas de microlitros de compuesto OCT y congélelo en hielo seco. Mantenga la muestra a esa temperatura. Extirpe un lóbulo pulmonar descelularizado de un ratón procesado, colóquelo en un molde criogénico con la mayor superficie hacia abajo y cúbralo con el compuesto OCT.Congele la muestra en hielo seco y manténgala a esa temperatura hasta que sea necesario. La muestra se puede almacenar durante al menos 12 semanas. Use un criostato para seccionar bloques de tejido congelado en secciones de cinco micrómetros a menos 20 grados centígrados.Y coloque las secciones en portaobjetos de vidrio adhesivo. Transfiera los portaobjetos a temperatura ambiente hasta que se sequen al aire. Sumerja brevemente las diapositivas en PBS, seguido de 4% de paraformaldehído en PBS durante 15 minutos.Lavar una vez en PBS, luego dos veces en agua destilada durante cinco minutos por lavado. Sumerja los portaobjetos en la solución de hematoxilina de Myer durante 10 minutos. A continuación, lave los portaobjetos en un frasco copeland con agua destilada durante 10 minutos y sumérjalos en solución de eosina durante siete minutos.Sumerja en xileno varias veces. Aplique unas gotas de medio de montaje DPX y coloque un resbalón de cubierta de vidrio. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche debajo de una capucha química y luego escanéelas en un escáner de diapositivas.Después de completar con éxito el protocolo, el corazón y los pulmones y el tejido NX estarán libres de células. La descelularización se puede validar mediante la tinción de eosina de hematoxilina de los andamios ecm. Los andamios conservan las dimensiones de los órganos frescos y su estructura ECM insoliable está intacta.Los andamios ECM mostraron una mayor permeabilidad y penetrabilidad de la luz. El uso de este protocolo con una etapa de microscopio motorizado permite obtener imágenes tridimensionales en mosaico de muestras de montaje completo a una resolución submicrométrica. Es esencial evitar el flujo hacia los órganos de interés para lograr una descelurización uniforme completa.La disección microquirúrgica y la ligadura de vasos deben ser efectivas. Y al mismo tiempo respetar los tejidos diana para mantener la estructura nativa de VCM. Después de este procedimiento, los andamios se enriquecerán para proteínas ECM estructurales y se pueden utilizar para espectrometría de masas o ingeniería de tejidos.Esta técnica allana el camino hacia el mapeo de alta resolución de la matriz extracelular.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Un modelo de ratón de la fatiga inducida por irradiación periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generación y el aislamiento de células de ciclo celular detenido con los Karyotypes complejos

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus de la entrega de guías CRISPR para la próstata murina por alteración del gen

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Generación rápida de cultivos primarios de melanocitos muritonos y fibroblastos

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Detección de ADN libre de células en muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantación y evaluación del melanoma en la coroides murina mediante tomografía de coherencia óptica

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Generación cíbrida transmitocondrial utilizando líneas celulares cancerosas

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...