Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Vi tackar prof. Ivana Novak och Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Köpenhamns universitet) för att de ger tillgång till mikroskop. Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR och JTE). ett doktorandstipendium från Lundbeckstiftelsen (R286-2018-621; MR); Vetenskapsrådet (2017-03389; CDM); Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj och 190007; CDM); Tyskt cancerhjälp (Deutsche Krebshilfe; RR). och Danska Cancerföreningen (R204-A12454; RR).

Alla förfaranden som ingår här har granskats och godkänts av den etiska kommitté som reglerar experimentell medicin vid Köpenhamns universitet och instämmer i dansk och europeisk lagstiftning. För att demonstrera detta protokoll har vi använt kvinnliga BALB/cJ möss i åldern 8-12 veckor och en MMTV-PyMT kvinnlig mus på 11 veckors ålder.
OBS: Att undvika bakteriell förorening av den decellulära ECM-ställningen ger det bästa bildframställningsresultatet och möjliggör långsikt...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

Decellularisering tekniker baserat på vävnad agitation ändra ECM struktur, vilket gör dem olämpliga för ECM struktur analys4. Perfusion decellularization, med hjälp av en anatomisk väg som luftstrupens aorta, gör det möjligt att nå kapillärbädden eller terminalalveoler, och underlättar leveransen av decellulariserande medel i hela organet. Användning av zwitterionic, an joniska och icke-joniska tvättmedel för att decellularisera vävnad rapporteras4,5,6, men natrium dodecylsulfat ...

ECM är ett tredimensionellt nätverk av proteiner och glykaner som rymmer alla celler i en multicellulär organism, vilket ger organ deras form och reglerar cellbeteende under hela livet1. Från äggbefruktning och framåt bygger och bygger celler ecm, och kontrolleras i sin tur strikt av den. Syftet med detta protokoll är att öppna ett sätt att analysera och kartlägga musen ECM, eftersom möss är den mest använda modellorganismen i däggdjurspatofysiologi.
Utvecklingen av denna metod drevs av behovet av att karakterisera och isolera metastasering-associerade inhemska ECM2. Eftersom tumörer saknar korrekt anatomisk vaskularisering och möss är relativt små organismer, var mikrokirurgiska förfaranden utformade för att bakåt catheterize aorta, samtidigt isolera cirkulationen av det stora kärlet som leder till en tumör (t.ex. pulmonell vener), således fokusera reagens flöde och tillåta tumör decellularization. Denna metod producerar ECM-byggnadsställningar med en bevarad struktur2 som kan immunostained och avbildas, vilket möjliggör ECM struktur mappning i submicron detalj. För att utföra detta protokoll är det nödvändigt att förvärva kirurgiska och mikrokirurgiska färdigheter (dissekering, mikrosutgning och kateterisering) som kan utgöra en potentiell begränsning av dess användning. Vår kännedom om detta är den senaste metoden för inbyggd ECM-struktur imaging analys2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

Vi presenterar här ett decellulariseringsprotokoll för mushjärta och lungor. Den producerar strukturella ECM-byggnadsställningar som kan användas för att analysera ECM-topologi och komposition. Det är baserat på ett mikrokirurgiskt förfarande som är utformat för att kateterisera luftstrupen och aortan hos en avlivad mus för att perfusera hjärtat och lungorna med decellulariserande medel. Decellularized cardiopulmonary komplexet kan därefter immunostained att avslöja platsen för strukturella ECM proteiner. Hela proceduren kan slutföras på 4 dagar.
ECM-byggnadsställningarna som härrör från detta protokoll är fria från dimensionella snedvridningar. Frånvaron av celler möjliggör strukturell undersökning av ECM strukturer ner till submicron upplösning i 3D. Detta protokoll kan tillämpas på frisk och sjuk vävnad från möss så unga som 4 veckor gamla, inklusive musmodeller av fibros och cancer, vilket öppnar vägen för att bestämma ECM-ombyggnad i samband med kardiopulmonell sjukdom.

Cardiopulmonary decellularization Efter att framgångsrikt ha slutfört protokollet kommer hjärtat och lungorna, liksom annexvävnad som aortabågen, att vara fria från celler. Decellularisering kan valideras genom hematoxylin-eosinfärgning (figur 1) av ECM-byggnadsställningarna som visar avlägsnande av atomkärnorna jämfört med den inhemska vävnaden. Dessa byggnadsställningar behåller dimensionerna av färska organ och dess olö...

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Detta protokoll syftar till att decellularisera hjärtat och lungorna hos möss. De resulterande extracellulära matrisen (ECM) byggnadsställningar kan immunostained och avbildas för att kartlägga platsen och topologin för deras komponenter.

Decellularisering av Murine Cardiopulmonary Complex

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Det här protokollet är porten till den extracellulära matrisen. Det är komplexitet och dess struktur ner till sub micron skala. Så den viktigaste fördelen med denna metod är att den gör det möjligt att få en extracellulär matris som behåller sin strukturella integritet och därmed öppnar vägen för biokemisk och anatomisk analys.Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten och Maria Rafaeva, som för närvarande befinner sig i mitt laboratorium och Chris Madsen och som var i mitt laboratorium och fortsatte arbetet vid Lunds universitet. Börja med att raka bröstkorgen, buken och baksidan av den avlivade musen med en hårklippare. Desinficera området med 70% etanol.Fäst sedan musen på en polystyrenbricka, förlänger dess fyra änd bakben, liksom huvudet och svansen. Placera den under mikrokirurgimikroskopet. Använd en Mayo rak mönster sax, gör ett testning snitt som löper från sub mandibular regionen till underlivet och dissekera subkutant för att exponera bröstväggen och bukhinnan.Använd sedan mikrokirurgiska saxar för att skära pectoralis major och pectoralis mindre muskler längs det sjätte interkostala utrymmet på båda sidor av bröstväggen. Skär bröstbenet längs de tidigare snitten med rak mönstersax. Slutför sedan en sternotomi genom att skära bröstbenet längs sin långa axel.Lyft och stifta, båda sidor av bröstväggen för att exponera kardiopulmonära komplexet. Använd runda spetsade mikrotångar för att ta bort tymus och omgivande fettvävnad genom att försiktigt dra bort dem från deras tillbehör. Och skär matstrupen med mikrosax.Separera brachiocephalic vener och brachiocephalic gatan med skarpa mikro tångar. Separera sedan den vänstra gemensamma halsartären och vänster subclavian artärer från den underliggande vävnaden för att underlätta ligatur och cauterization. Använd en microneedle hållare och skarpa mikro tång och en nio oh suture för att placera stygn ovanför framväxten av brachiocephalic vänster gemensamma halsartär och vänster subclavian artärer, cauterize brachiocephalic vener.Använd mikrosax, öppna en ingång genom att dela ligamentet. Introducera en 27 gauge kateter i luftstrupen och tryck försiktigt tills luftstrupen förgrenas i bronkierna, var försiktig så att du inte stör bronkierna. Använd en sex O sutur, placera tre stygn runt luftstrupen för att säkra katetern.Dela upp musen på höjden av den 12: e bröstkotan, den fallande Aorta löper främre till ryggraden och bör delas här tillsammans med ryggraden. Bakåtkatetera Aorta och tryck katetern tills den når aortabågen. Använd en sutur och placera fyra stygn runt Aorta, med början fem millimeter under kateterspetsen.Anslut musen till ett pumpsystem med silikonrör och nedre kontakter. Perfusera med avjoniserat vatten vid 200 mikroliter per minut i 15 minuter. Byt sedan perfusionsmedlet till 0,5%DOC, utspädd i dejoniserat vatten och perfuse över natten.Nästa dag, ändra perfusionsmedlet till 0,1%SDS utspädd i avjoniserat vatten och perfusera i åtta timmar. Perfusera sedan med avjoniserat vatten i 24 timmar för att tvätta bort SDS och DOC. Skicka det decellulära hjärtat och lungorna genom att dela upp dess bilagor till bröstkorgen.Förvara vävnaden i ett sterilt kryorör i avjoniserat vatten med 1% penicillin streptomycin och 0,3 mikromolar natriumazid vid fyra grader Celsius. För att utföra immunfärgning, blockera provet genom att inkubera det i ett kryorör som innehåller 6% åsneserum och 3%BSA över natten. Inkubera sedan med primär antikropp i 3% åsneserum i PBS i 24 timmar.Efter inkubationstvätten tvätta provet fem gånger i PBST i en timme per tvätt. Inkubera provet med fluorescerande konjugerad sekundär antikropp i 3% åsneserum i PBS i 24 timmar. Upprepa sedan tvättarna i PBST.Tillsätt det joniserade vattnet och förvara provet vid fyra grader Celsius bort från direkt ljus. För att avbilda provet, placera det i en glasbottenskål och fukta den med två droppar lagring av lösningen. Ställ in målet och inspektera provet med hjälp av fluorescensljus.Byt till datorstyrning, slå på lasrar och justera laserintensitet, pinhole bländare, detektorer våglängd, förstärkning, upplösning och zoom. Ange nummer och stegstorlek för Z-stacken och börja sedan anskaffningen. Ta bort en lunglob från en avlivad mus och placera den i en 10 x 10 x fem millimeter kryoform.Täck den med cirka 800 mil mikroliter OCT-förening och frys den på torris. Håll provet vid den temperaturen. Punkt punkt ett decellulariserat lunglob från en bearbetad mus, placera den i en kryoform med den största ytan ner och täck den med OCT-förening.Frys provet på torris och håll det vid den temperaturen tills det annars krävs. Provet kan förvaras i minst 12 veckor. Använd en kryostat för att dela upp frysta vävnadsblock i fem mikrometersektioner vid minus 20 grader Celsius.Och placera sektionerna på självhäftande glasrutschbanor. Överför rutschkanorna till rumstemperatur tills luften torkat. Sänk ned bilderna i PBS en kort stund, följt av 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minuter.Tvätta en gång i PBS, sedan två gånger i destillerat vatten i fem minuter per tvätt. Sänk ned bilderna i Myers hematoxylinlösning i 10 minuter. Tvätta sedan rutschkanorna i en Copeland-burk under rinnande destillerat vatten i 10 minuter och sänk ner i eosinlösning i sju minuter.Doppa i xylen flera gånger. Applicera några droppar DPX monteringsmedium och placera en glasskyddslapp. Låt rutschkanorna torka över natten under en kemisk huva och skanna dem sedan i en bildskanner.Efter att framgångsrikt ha slutfört protokollet kommer hjärtat och lungorna och NX-vävnaden att vara fria från celler. Decellularisering kan valideras genom hematoxylin eosin färgning av ECM byggnadsställningar. Ställningarna behåller dimensionerna av färska organ och dess otillsägliga ECM-struktur är intakt.ECM byggnadsställningar visade ökad permeabilitet och lätt penetrability. Genom att använda detta protokoll med ett motoriserat mikroskopsteg möjliggörs tredimensionell kaklad avbildning av hela monteringsprover med submikronupplösning. Det är viktigt att undvika att flyga mot de organ som är av intresse för att uppnå fullständig enhetlig decellurisering.Den mikrokirurgiska dissekeringen och ligaturen av fartyg måste vara effektiv. Och samtidigt respektera målvävnaderna för att upprätthålla infödd VCM-struktur. Efter denna procedur kommer ställningarna att berikas för strukturella ECM-proteiner och kan användas för masspektrometri eller vävnadsteknik.Denna teknik banar väg för högupplöst kartläggning av den extracellulära matrisen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musmodell av trötthet inducerad av perifera bestrålning

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generation och isolering av cellcykeln-arresterade celler med komplexa Karyotypes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En självlysande och fluorescerande ortotop syngena murina modell av Androgen-beroende och kastrationsresistent prostatacancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus leverans av CRISPR guider till murina prostatan för gen ändring

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Snabb generering av primär murina melanocyte och fibroblast kulturer

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Murin modell av metastaserande levertumörer i inställningen av ischemia reperfusion skada

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In vitro inrättande av en genetiskt modifierad murin huvud och hals cancer cellinjer med ett Adeno-associerat virus-Cas9 system

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Påvisande av cellfritt DNA i blodplasmaprover från cancerpatienter

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation och utvärdering av melanom i murin choroid via optisk koherenstomografi

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Transmitokondriell cybridgenerering med hjälp av cancercellinjer

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...