Name: decellularization of the murine cardiopulmonary complex
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Prof. Ivana Novak ve Dr. Nynne Meyn Christensen'e (Kopenhag Üniversitesi İleri Biyogörüntleme Merkezi)'ne mikroskop erişimi sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR ve JTE); Lundbeck Vakfı'ndan doktora bursu (R286-2018-621; SN. ); İsveç Araştırma Konseyi (2017-03389; CDM); İsveç Kanser Derneği, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj ve 190007; CDM); Alman Kanser Yardımı (Deutsche Krebshilfe; RR); ve Danimarka Kanser Derneği (R204-A12454; RR).

Burada yer alan tüm prosedürler Kopenhag Üniversitesi'nde deneysel tıbbı düzenleyen etik komite tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır ve Danimarka ve Avrupa mevzuatına uygundur. Bu protokolü göstermek için, 8-12 haftalık dişi BALB / cJ fareleri ve 11 haftalık bir MMTV-PyMT dişi fare kullandık.
NOT: Hücreden çıkarımlı ECM iskelesinin bakteriyel kirlenmesini önlemek en iyi görüntüleme sonucunu verir ve uzun süreli numune depolamaya izin verir. Bu nedenle t...

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDoT:+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix.">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li><li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process:+A+TOF-sims+study.">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix.">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li></ol>

Doku ajitasyonuna dayalı desellülerizasyon teknikleri ECM yapısını değiştirerek ECM yapı analizi için uygun hale getirir4. Trakea aort gibi anatomik bir yol kullanarak perfüzyon desellülerizasyonu kılcal yatağa veya terminal alveollere ulaşmayı sağlar ve hücreden çıkarıcı ajanların organ boyunca teslimini kolaylaştırır. Dokuyu hücreden çıkarmak için zwitteriyonik, anionik ve iyonik olmayan deterjanların kullanımı4,5,6<su...

ECM, çok hücreli bir organizmadaki tüm hücreleri barındıran, organlara şekil veren ve yaşam boyunca hücre davranışını düzenleyen protein ve glikanlardan oluşan üç boyutlu bir ağdır1. Yumurta döllenmesinden itibaren, hücreler ECM'yi oluşturur ve yeniden şekillendirir ve buna karşılık kesinlikle kontrol edilir. Bu protokolün amacı, fareler memeli patofizyolojisinde en çok kullanılan model organizma olduğu için fare ECM'yi analiz etmenin ve haritalamak için bir yol açmaktır.
Bu yöntemin gelişimi, metastaz ilişkili yerel ECM2'yi karakterize etme ve izole etme ihtiyacından kaynaklanmıştır. Tümörler uygun anatomik vaskülerizasyondan yoksun olduğundan ve fareler nispeten küçük organizmalar olduğundan, mikrocerrahi prosedürler aortu geriye dönük kateterize etmek için tasarlanmıştır, bu nedenle tümöre (örneğin pulmoner damarlara) giden ana damarın dolaşımını izole eder, böylece reaktif akışına odaklanır ve tümör desellülerizasyonuna izin verir. Bu yöntem, bağışıklık sistemi baskılanabilen ve görüntülenebilen korunmuş bir yapıya2 sahip ECM iskeleleri üreterek ecm yapısının altmikron detaylı olarak haritalandırılmasını sağlar. Bu protokolü gerçekleştirmek için, kullanımına potansiyel bir sınırlama oluşturabilecek cerrahi ve mikrocerrahi becerileri (diseksiyon, mikrosütür ve kateterizasyon) kazanmak gerekir. Bilgimize göre, bu yöntem yerel ECM yapı görüntüleme analizi için en son teknolojiyi temsil eder2,3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSURGERY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6301124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-0 micro-suture (Safil)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>G1048611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps with teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo microneedle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>no. 12061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tray (~30 &#215; 50 cm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-ended microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont microforceps with 45&#176; tips (two)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Oster</td>
			<td>76998-320-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)</td>
			<td>Surflo-W</td>
			<td>SR+DM2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors (tough cut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps with ringed tips (two)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>FM571R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spring scissors (Vannas, curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicutter</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>80-008-03-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molt Periostotome</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>D0543R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 gauge; Microlance)</td>
			<td>BD</td>
			<td>21018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel (sterile) or surgical napkin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated scissors (CeramaCut, straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula (Freer-Yasargil)</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>OL166R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (1 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL; Plastipak)</td>
			<td>BD</td>
			<td>3021110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tendon scissors (Walton)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14077-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>11930.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Host: rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td>Host: goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Host: guinea pig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>233-5364)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum (normal donkey serum)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fluorescence light source&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EL6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microscope (inverted multiphoton microscope)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5-X MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Objective (lambda blue, 20&#215;, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX PL APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Two-photon Ti&#8211;sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;White-light laser (WLL)&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DECELLULARIZATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water&#160;</td>
			<td>Plum</td>
			<td>1680766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>13158-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 7.4, 10&#215;, Gibco)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (with 12 channels)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>110AC(R)20G75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)</td>
			<td>Ole Dich</td>
			<td>31399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (DOC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E STAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15434389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201446-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Plum</td>
			<td>201152-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>422.245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td>1001.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution alcoholic 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1024390500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)</td>
			<td>Pfm medical</td>
			<td>207500003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>6319483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayers hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS32-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide scanner (Nanozoomer)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of the murine cardiopulmonary complex

Burada fare kalbi ve akciğerleri için bir hücreden arındırma protokolü sunuyoruz. ECM topolojisini ve bileşimini analiz etmek için kullanılabilecek yapısal ECM iskeleleri üretir. Kalbi ve akciğerleri hücreden çıkarıcı ajanlarla boğmak için ötenazili bir farenin trakeasını ve aortlarını kateterize etmek için tasarlanmış mikrocerrahi bir prosedüre dayanmaktadır. Hücreden çıkarıcı kardiyopulmoner kompleks daha sonra yapısal ECM proteinlerinin yerini ortaya çıkarmak için immünositize edilebilir. Tüm prosedür 4 günde tamamlanabilir.
Bu protokolden kaynaklanan ECM iskeleleri boyutsal bozulmalardan arındırılmıştır. Hücrelerin yokluğu, ECM yapılarının 3D olarak mikrokron çözünürlüğe kadar yapısal olarak incelenmesini sağlar. Bu protokol, fibrozis ve kanserin fare modelleri de dahil olmak üzere 4 haftalık kadar genç farelerden sağlıklı ve hastalıklı dokulara uygulanabilir ve kardiyopulmoner hastalıkla ilişkili ECM tadilatını belirlemenin yolunu açar.

Kardiyopulmoner desellülerizasyon Protokolü başarıyla tamamladıktan sonra kalp ve akciğerlerin yanı sıra aort arkı gibi ek dokular hücrelerden arındırılmış olacaktır. Desellülerizasyon, ecm iskelelerinin hematoksilin-eozin lekelenmesi (Şekil 1) ile doğrulanabilir. Bu iskeleler taze organların boyutlarını korur ve çözünmeyen ECM yapısı bozulmadan kalır2. Şekil 2</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex at JoVE.com

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Bu protokol farelerin kalbini ve akciğerlerini hücreden çıkarmayı amaçlamaktadır. Elde edilen hücre dışı matris (ECM) iskeleleri, bileşenlerinin konumunu ve topolojisini haritalamak için immünostain edilebilir ve görüntülenebilir.

Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Bu protokol hücre dışı matrise açılan kapıdır. Karmaşıklık ve yapısı mikron ölçeğine kadar iniyor. Bu nedenle, bu yöntemin temel avantajı, yapısal bütünlüğünü koruyan hücre dışı bir matris elde etmeyi mümkün kılmaktadır, böylece biyokimyasal ve anatomik analizin yolunu açmaktadır.Prosedürü gösterenler, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten ve Maria Rafaeva, şu anda laboratuvarımda ve Chris Madsen ve laboratuvarımda bulunan ve Lund Üniversitesi'nde çalışmaya devam eden. Ötenazili farenin toraksını, karnını ve sırtını saç kesme makinesi ile tıraş darak başlayın. Bölgeyi% 70 etanol ile dezenfekte edin.Daha sonra fareyi bir polistiren tepsiye sabitleyin, dört uçlu arka uzuvlarını, başını ve kuyruğunu uzatın. Mikrocerrahi mikroskobun altına yerleştirin. Mayo düz desen makası kullanarak, alt mandibular bölgeden alt karın bölgesine doğru akan bir kese kesisi yapın ve torasik duvarı ve peritonları ortaya çıkarmak için deri altından parçalara bölün.Daha sonra torasik duvarın her iki tarafındaki altıncı interkostal boşluk boyunca pektoralis majör ve pektoralis küçük kaslarını kesmek için mikrocerrahi makas kullanın. Sternumu önceki kesiler boyunca düz desen makası ile kesin. Daha sonra sternumu uzun ekseni boyunca keserek sternotomiyi tamamlayın.Kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için torasik duvarın her iki tarafını yükseltin ve sabitlayın. Timus ve çevresindeki yağ dokusunu hassas bir şekilde ataşmanlarından çekerek çıkarmak için yuvarlak uçlu mikro toparlamalar kullanın. Ve yemek borusunu mikro makasla kesin.Brachiocephalic veinleri ve brakiyofalik arteri keskin mikro torptiklerle ayırın. Daha sonra ligasyon ve koterizasyonu kolaylaştırmak için sol ortak karotis ve sol subklavyan arterleri alttaki dokudan ayırın. Brakiyofalik sol ortak karotis ve sol subklavyan arterlerin ortaya çıkışının üzerine dikişler yerleştirmek için bir mikroneedle tutucu ve keskin mikroasipler ve dokuz oh dikiş kullanın, brakiyofalik damarları dağlayın.Mikro makas kullanarak, bağı bölümlere alarak bir giriş açın. Nefes borusuna 27 ölçer kateter takın ve bronşlara trakea dallarına kadar hassas bir şekilde itin, bronşları bozmamaya dikkat edin. Altı O dikişi kullanarak, kateteri sabitlemek için nefes borusunun etrafına üç dikiş yerleştirin.12. torasik omurun yüksekliğinde fareyi bölümlendirin, alçalan Aorta omurgaya doğru ön sırada çalışır ve omurga ile birlikte burada bölümlenmelidir. Aort katerazörünü retrograd olarak katetere alın ve kateteri aort arkına ulaşana kadar itin. Bir dikiş kullanarak, kateter ucunun beş milimetre altından başlayarak Aorta'nın etrafına dört dikiş yerleştirin.Silikon boru ve daha düşük konektörler kullanarak fareyi bir pompa sistemine bağlayın. 15 dakika boyunca dakikada 200 mikrolitre deiyonize su ile perfuse. Daha sonra perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0.5 DOC olarak değiştirin ve bir gecede perfüzyon.Ertesi gün, perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0.1 SDS olarak değiştirin ve sekiz saat boyunca perfüzyon. Daha sonra SDS ve DOC'u yıkamak için 24 saat boyunca deiyonize su ile perfüzyona uğrayın.Dokuyu steril bir kriyo tüpünde% 1 penisilin streptomisin ve dört santigrat derecede 0.3 mikromoler sodyum azit ile deiyonize suda saklayın. İmmün lekelenme yapmak için örneği bir gecede %6 eşek serumu ve %3 BSA içeren bir kriyo tüpüne inkübe ederek engelleyin. Daha sonra PBS'de % 3 eşek serumunda 24 saat primer antikor ile kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra numuneyi PBST'de beş kez yıkama başına bir saat yıkayın. PBS'de %3 eşek serumunda floresan konjuge sekonder antikor ile numuneyi 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Ardından yıkamaları PBST'de tekrarlayın.İyonize suyu ekleyin ve numuneyi doğrudan ışıktan dört santigrat derecede saklayın. Örneği görüntülemek için, cam bir alt tabağa yerleştirin ve iki damla damla çözeltisi ile nemlendirin. Hedefi belirleyin ve floresan ışığı kullanarak numuneyi inceleyin.Bilgisayar kontrolüne geçin, lazerleri açın ve lazer yoğunluğunu, iğne deliği diyaframını, dedektörlerin dalga boyunu, kazancını, çözünürlüğünü ve yakınlaştırmasını ayarlayın. Z yığını için sayı ve adım boyutunu ayarlayın, sonra edinmeye başlayın. Bir akciğer lobu ötanazili bir fareden geçirin ve 10'a 10 ila 5 milimetre kriyo kalıbına yerleştirin.Yaklaşık 500 mil oct bileşiği ile örtün ve kuru buz üzerinde dondurun. Numuneyi o sıcaklıkta tut. İşlenmiş bir fareden bir hücreden çıkarmış akciğer lobu çıkar, en büyük yüzey alanı aşağı olan bir kriyo kalıbına yerleştirin ve OCT bileşiği ile örtün.Numuneyi kuru buz üzerinde dondurun ve aksi gerekmedilene kadar bu sıcaklıkta saklayın. Örnek en az 12 hafta saklanabilir. Donmuş doku bloklarını eksi 20 santigrat derecede beş mikrometre bölümüne bölümlere ayırdık için kriyostat kullanın.Ve bölümleri yapışkan cam slaytlara yerleştirin. Slaytları hava kuruyana kadar oda sıcaklığına aktarın. Slaytları PBS'ye kısaca daldır, ardından 15 dakika boyunca PBS'de %4 paraformaldehit.PBS'de bir kez, daha sonra iki kez damıtılmış suda yıkama başına beş dakika yıkayın. Slaytları Myer'in hematoksilin çözeltisinde 10 dakika boyunca daldırin. Daha sonra, slaytları 10 dakika boyunca damıtılmış su altında bir Copeland kavanozunda yıkayın ve yedi dakika boyunca eosin çözeltiye daldırin.Xylene'e birkaç kez daldırın. Birkaç damla DPX montaj ortamı uygulayın ve bir cam kapak kayması yerleştirin. Slaytları kimyasal bir başlık altında bir gecede kurumaya bırakın ve ardından bir slayt tarayıcısında tarayın.Protokolü başarıyla tamamladıktan sonra kalp ve akciğerler ile NX dokusu hücrelerden arındırılmış olacaktır. Hücreden arındırma, ECM iskelelerinin hematoksilin eozin boyanma ile doğrulanabilir. İskeleler taze organların boyutlarını korur ve insoliable ECM yapısı bozulmamış.ECM iskeleleri geçirgenliğin ve hafif penetrabilliğin arttığını gösterdi. Bu protokolün motorlu bir mikroskop aşaması ile kullanılması, tüm montaj örneklerinin alt mikron çözünürlüğünde üç boyutlu karo görüntülemesini sağlar. Komple decellurizasyon elde etmek için ilgi organlarına doğru akıştan kaçınmak önemlidir.Damarların mikrocerrahi diseksiyonu ve ligasyonu etkili olmalıdır. Ve aynı zamanda yerel VCM yapısını korumak için hedef dokulara saygı gösterin. Bu prosedürden sonra, iskeleler yapısal ECM proteinleri için zenginleştirilecek ve kütle spektrometresi veya doku mühendisliği için kullanılabilir.Bu teknik, hücre dışı matrisin yüksek çözünürlüklü haritalandırılmasına giden yolu açmaktadır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Periferik Radyasyonla Bağlı Yorgunluk A Fare Modeli

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Kollarındaki ve floresan Orthotopic Syngeneic fare modeli androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Primer Murine melanosit ve fibroblast kültürlerinin hızlı üretimi

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

İskemi Reperfüzyon Hasarı Ayarında Metastatik Karaciğer Tümörlerinin Murine Modeli

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Murin Koroidinde Melanomun İmplantasyonu ve Optik Koherens Tomografi ile Değerlendirilmesi

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines (Video) | JoVE 

Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletimkokondriyal Cybrid Üretimi

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...