Name: preparation of decellularized kidney scaffolds in rats
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af en Biomedical Research Institute Grant fra Pusan National University Hospital.

Denne undersøgelse blev godkendt af administrationen af Pusan National University of Medicine og blev udført i overensstemmelse med etiske retningslinjer for brug og pleje af dyr. (certifikat nr. 2017-119). Forud for dyreforsøg bør der indhentes institutionel godkendelse. BEMÆRK: Alle kirurgiske instrumenter og bedøvelsesinstrumenter/-udstyr og reagenser, der anbefales til vellykket kirurgisk præsentation og billeddannelse af abdominalorganer, er beskrevet i tabel 1.
1...

<ol>
	<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression.">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li><li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering.">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li><li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering.">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li><li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+amniotic+membrane+(AM)+denuding+for+tissue+engineering.">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels.">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).</li><li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle;+implications+for+muscle+tissue+engineering.">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+definition+of+regenerative+medicine.">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li></ol>

Forskellige protokoller er blevet brugt til decellularisering af organer og andet væv. Den optimale decellulariseringsprotokol skal bevare den tredimensionale arkitektur i den ekstracellulære matrix (ECM). Generelt består sådanne protokoller i at lyse cellemembranen ved fysisk behandling eller ioniske opløsninger, adskille cytoplasmaet og kernen fra ECM ved enzymatisk behandling eller rengøringsmidler og derefter fjerne celleaffald fra vævet3. Fysiske processer omfatter skrabning, opløsnin...

Cellekultur teknikker anvendes til regenerering af funktionelle væv og organer til at erstatte syge eller beskadigede organer. Allogen organtransplantation er i øjeblikket den mest almindelige behandling for uoprettelig organskade; denne fremgangsmåde kræver dog brug af immunosuppression for at forhindre afvisning af det transplanterede organ. På trods af fremskridt inden for transplantationsvaccination kan 20 % af transplantationsmodtagerne desuden opleve akut afvisning inden for 5 år, og inden for 10 år efter transplantationen kan 40 % af modtagerne miste deres transplanterede graft eller dø1.
Fremskridt inden for vævsteknikteknologier har givet efter i et nyt paradigme for transplantation af nye organer uden immunafstødning ved hjælp af differentierede stamceller. Efter stamcelledifferentiering er der brug for et stillads, kaldet en syntetisk ekstracellulær matrix, for at lette produktionen af tredimensionelle organer og gøre det muligt for det nye væv at trives i modtageren. Stilladser fra decellulariserede indfødte organer har fordele, herunder et mere effektivt miljø for etablering af celler og forbedring af stamcellespredning, selv om disse mekanismer ikke er fuldt belyst2. Især nyrerne er et egnet organ til stilladsgeneration, fordi det har rigelig cirkulation og en niche til stamcellevirksomhed. Derudover er det på grund af den komplekse struktur i nyrerne svært at kunstigt regenerere nyrer til organtransplantation.
I denne rapport introducerer vi en metode til udvikling af vaskulære stilladser ved hjælp af decellulariserede organer i en rottemodel for at lette fremtidige dyreforsøg til vævstekniske formål.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 ethilon for vessel anastomosis</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>9032G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 PDS incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z316H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Prolene incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8832H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk spool vascular access/ligation in rat</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 PDS incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z773D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Prolene incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8831H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors to cut fascia/connective tissue</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>.023&#34; &#215; .038&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz microserrefine vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01 (straight)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18052-03 (curved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors to cut skin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of decellularized kidney scaffolds in rats

Vævsteknik er en banebrydende disciplin inden for biomedicin. Cellekultur teknikker kan anvendes til regenerering af funktionelle væv og organer til at erstatte syge eller beskadigede organer. Stilladser er nødvendige for at lette produktionen af tredimensionelle organer eller væv ved hjælp af differentierede stamceller in vivo. I denne rapport beskriver vi en ny metode til udvikling af vaskulære stilladser ved hjælp af decellulariserede rotte nyrer. Otte uger gamle Sprague-Dawley rotter blev brugt i denne undersøgelse, og heparin blev injiceret i hjertet for at lette strømmen ind i nyrefartøjerne, så heparin kunne gennemgå nyrefartøjerne. Bukhulen blev åbnet, og den venstre nyre blev indsamlet. De indsamlede nyrer blev perfunderet i 9 timer ved hjælp af rengøringsmidler, såsom Triton X-100 og natrium dodecyl sulfat, for at decellularisere vævet. Decellulariserede nyrestilladser blev derefter forsigtigt vasket med 1% penicillin / streptomycin og heparin for at fjerne cellulært affald og kemiske rester. Transplantation af stamceller med decellulariserede vaskulære stilladser forventes at lette produktionen af nye organer. Således kan de vaskulære stilladser give et fundament for vævsteknik af organtransplantationer i fremtiden.

Den grove morfologi af rotte nyrer var mørkerød (Figur 1A). Efter afcellularisering blev nyrerne blege og gennemskinnelige (Figur 1D). Resterende genomisk DNA blev vurderet med et kommercielt kit i henhold til producentens anvisninger, i decellulariserede nyrestilladser og sammenlignet med det i indfødte nyrer (kontrol). Kvantitativ analyse bekræftede, at vævsgenomisk DNA næsten blev elimineret efter afcellularisering. Fra 14 tilfælde var det gennemsnitli...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Denne protokol introducerer en metode til at udvikle et stillads ved hjælp af decellulariserede rotte nyrer. Protokollen indeholder decellulariserings- og recellulariseringsprocesser for at bekræfte biotilgængelighed. Decellularisering udføres ved hjælp af Triton X-100 og natrium dodecyl sulfat.

Forberedelse af decellulariserede nyrestilladser hos rotter

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

Denne protokol gør det muligt at udvikle vaskulære stilladser ved hjælp af nyrer i en rottemodel. Nyrerne er det mest egnede organ til stilladser af differentierede stamceller. Dette er en meget vellykket protokol for decellularisering af nyrerne.Det fjerner effektivt kernerne med minimal ødelæggelse af ECM ultrastruktur. Denne teknik kan anvendes til transplantation medicin og væv engineering. Demonstration af proceduren vil være Kim Joo Hyoung, en MD / ph.d.-lektor i plastikkirurgi fra mit laboratorium.Til at begynde med skal du placere den otte uger gamle Sprague Dawley-rotte på en opvarmningspude og placere en rektal termometersonde i endetarmen for at overvåge kernetemperaturen. Efter bedøvelse af rotten skal du placere den i en liggende stilling og fastgøre de fire lemmer til bordet med tape. Barber og rengør maven med germicidal sæbe.Påfør 2%Betadine i mindst et til to minutter, og tør det derefter af med en 70%ethanolopløsning. Gentag denne sekvens tre gange. Dæk det operative felt med en steril, fenestrated drapering.Lav en lodret abdominal snit, og udsætte venstre nyre, ureter, abdominal aorta, og ringere vena cava. Dissekere vævet lige før skære pedicle. Der fremstilles 50 milliliter perfusionsopløsning pr. rotte ved at blande PBS med ca. 10 enheder pr. milliliter heparin.Bland lige store mængder af 8%PFA med PBS for at fremstille 4%PFA-løsningen. Udvid det lodrette abdominale snit kranialt, og sørg for at trække saksen væk fra organerne, når du skærer for at undgå skader. Fortsæt snittet gennem brystkassen, og skær derefter gennem mellemgulvet ved at løfte brystbenet.Træk den løse flap af huden af vejen med en Allis klemme, og befri hjertet ved at rive enhver bindevæv med pincet. Åbn PBS-linjen, og sørg for, at den flyder, før du placerer nålen i venstre hjertekammer. Hold hjertet forsigtigt med stumpe pincet, og brug en hæmostat til at styre nålen.Nålen bør indsættes ikke mere end en kvart tomme. Mens du støtter hjertet med nålen og hæmostaten, skal du finde det rigtige atrium og klippe gennem det med iridektomisaks. Hvil hæmostaten på rottens krop, og sørg for, at nålen stadig er placeret inde i hjertet.Fortsæt perfusing PBS i fire minutter eller længere, hvis der stadig er blod synligt i nyrerne og leveren. Høst venstre nyre med abdominal aorta og ringere vena cava. Ligate ureter, thoracic aorta, overlegen vena cava, og grene af abdominal aorta.Hold orgelet hydreret i DPBS i en 10 centimeter petriskål. Cannulate abdominal aorta og ringere vena cava med et 23-gauge kateter. For at fjerne restblod skal du forbinde kanylen med en peristaltisk pumpe og vaske organet med 500 milliliter DPBS og 16 enheder pr. milliliter heparin i 90 minutter ved fem omdrejninger i minuttet og 37 grader Celsius.For at decellularisere nyrerne skal du gennemgå den med 1%Triton X-100 i tre timer og derefter med 0,75% SDS-opløsning i seks timer ved et konstant tryk på 40 milliliter kviksølv. For at fjerne rest-SDS skal prøven med 1%penicillin i destilleret vand gennemgås i 18 timer og derefter med steril DPBS og 16 enheder pr. milliliter heparin i 90 minutter. Den grove morfologi af rotte nyrer var mørkerød.Efter afcellularisering blev nyrerne blege og gennemskinnelige. Resterende genomisk DNA blev kvantificeret i decellulariserede nyrestilladser og sammenlignet med det i indfødte nyrer, hvilket bekræftede, at vævsgenomisk DNA næsten blev elimineret efter decellularisering. Fra 14 tilfælde var det gennemsnitlige DNA-indhold 115,05 nanogram pr. mikroliter til styringen og 1,96 nanogram pr. mikroliter for det decellulerede stillads.I alt blev 98,3% af DNA fjernet. Den tredimensionelle struktur blev opretholdt, og acellulære glomeruli blev bevaret i kortikale parenchyma. Når du indsætter nålen i venstre hjertekammer, bør den ikke indsættes mere end en kvart tomme.Enhver yderligere indsættelse kan komme ud på den anden side. Vi har tillid til, at denne teknik vil åbne et nyt perspektiv inden for vævsteknik.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopisk tyndtarmstransplantation i rotter

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Orthotopic Liver Transplantation in Rats

Ortotopisk levertransplantation i rotter

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Vurdering af vaskulære funktion hos patienter med kronisk nyresygdom

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Murine Kidney Transplant Technique

Murine nyretransplantation Teknik

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex vivo</em&gt; Nyre Perfusion for Bevarelse af Nyre grafts før Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Histologisk Kvantificering af kronisk hjerteinfarkt i rotter

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Vurdering af nyrefunktion i musemodeller af glomerulær sygdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Trombocyt-baseret detektion af nitrogenoxid i blodet ved at måle VASP fosforylering

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

One-anastomosis Gastric Bypass (OAGB) in Rats

One-anastomosis Gastric Bypass OAGB in Rats

One-anastomose Gastric Bypass (OAGB) hos rotter

The goal of this protocol is to set up a preclinical model of bariatric surgery and, more specifically, OAGB in obese rats. Based on this preclinical ...