Name: preparation of decellularized kidney scaffolds in rats
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door een Biomedical Research Institute Grant van pusan National University Hospital.

Deze studie werd goedgekeurd door de administratie van de Pusan National University of Medicine en werd uitgevoerd in overeenstemming met ethische richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van dieren. (certificaatnr. 2017-119). Voorafgaand aan dierproeven moet een institutionele goedkeuring worden verkregen. OPMERKING: Alle chirurgische en verdovingsinstrumenten/apparatuur en reagentia die worden aanbevolen voor een succesvolle chirurgische presentatie en beeldvorming van buikorganen zijn beschreven in tab...

<ol>
	<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression.">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li><li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering.">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li><li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering.">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li><li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+amniotic+membrane+(AM)+denuding+for+tissue+engineering.">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels.">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).</li><li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle;+implications+for+muscle+tissue+engineering.">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+definition+of+regenerative+medicine.">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li></ol>

Verschillende protocollen zijn gebruikt voor decellularisatie van organen en andere weefsels. Het optimale decellularisatieprotocol moet de driedimensionale architectuur van de extracellulaire matrix (ECM) behouden. Over het algemeen bestaan dergelijke protocollen uit het lyseren van het celmembraan door fysieke verwerking of ionische oplossingen, het scheiden van het cytoplasma en de kern van het ECM door enzymatische verwerking of detergentia, en vervolgens het verwijderen van cellulair puin uit het weefsel<sup class="...

Celkweektechnieken worden toegepast voor regeneratie van functionele weefsels en organen ter vervanging van zieke of beschadigde organen. Allogene orgaantransplantatie is momenteel de meest voorkomende behandeling voor onomkeerbare orgaanschade; deze aanpak vereist echter het gebruik van immunosuppressie om afstoting van het getransplanteerde orgaan te voorkomen. Bovendien kan, ondanks de vooruitgang in de transplantatieimmunologie, 20% van de transplantatieontvangers binnen 5 jaar acute afstoting ervaren en binnen 10 jaar na transplantatie kan 40% van de ontvangers hun getransplanteerde transplantaat verliezen of sterven1.
Vooruitgang in weefseltechnologietechnologieën heeft geleid tot een nieuw paradigma voor transplantatie van nieuwe organen zonder immuunafstoting met behulp van gedifferentieerde stamcellen. Na stamceldifferentiatie is een steiger nodig, een synthetische extracellulaire matrix genaamd, om de generatie van driedimensionale organen te vergemakkelijken en het nieuwe weefsel in staat te stellen te gedijen in de ontvanger. Steigers van gedecellulariseerde inheemse organen hebben voordelen, waaronder een effectievere omgeving voor de vestiging van cellen en verbetering van de proliferatie van stamcellen, hoewel deze mechanismen niet volledig zijn opgehelderd2. In het bijzonder is de nier een geschikt orgaan voor steigergeneratie omdat het een overvloedige circulatie heeft en een niche voor stamcelinrichting. Bovendien is het vanwege de complexe structuur van de nier moeilijk om nieren kunstmatig te regenereren voor orgaantransplantatie.
In dit rapport introduceren we een methode om gevasculariseerde steigers te ontwikkelen met behulp van gedecellulariseerde organen in een rattenmodel om toekomstige dierstudies voor weefseltechnologiedoeleinden te vergemakkelijken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 ethilon for vessel anastomosis</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>9032G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 PDS incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z316H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Prolene incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8832H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk spool vascular access/ligation in rat</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 PDS incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z773D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Prolene incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8831H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors to cut fascia/connective tissue</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>.023&#34; &#215; .038&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz microserrefine vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01 (straight)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18052-03 (curved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors to cut skin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of decellularized kidney scaffolds in rats

Tissue engineering is een geavanceerde discipline in de biogeneeskunde. Celkweektechnieken kunnen worden toegepast voor regeneratie van functionele weefsels en organen ter vervanging van zieke of beschadigde organen. Steigers zijn nodig om de generatie van driedimensionale organen of weefsels te vergemakkelijken met behulp van gedifferentieerde stamcellen in vivo. In dit rapport beschrijven we een nieuwe methode voor het ontwikkelen van gevasculariseerde steigers met behulp van gedecellulariseerde rattennieren. Acht weken oude Sprague-Dawley ratten werden gebruikt in deze studie, en heparine werd geïnjecteerd in het hart om de stroom in de niervaten te vergemakkelijken, waardoor heparine in de niervaten kon doordringen. De buikholte werd geopend en de linkernier werd verzameld. De verzamelde nieren werden gedurende 9 uur geperfuseerd met behulp van detergentia, zoals Triton X-100 en natriumdodecylsulfaat, om het weefsel te decellulariseren. Gedecellulariseerde niersteigers werden vervolgens voorzichtig gewassen met 1% penicilline/streptomycine en heparine om cellulair puin en chemische residuen te verwijderen. Transplantatie van stamcellen met de gedecellulariseerde vasculaire steigers zal naar verwachting de generatie van nieuwe organen vergemakkelijken. Zo kunnen de gevasculariseerde steigers in de toekomst een basis vormen voor weefseltechnologie van orgaantransplantaten.

De grove morfologie van rattennieren was donkerrood (figuur 1A). Na decellularisatie werd de nier bleek en doorschijnend (figuur 1D). Resterend genomisch DNA werd beoordeeld met een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant, in gedecellulariseerde niersteigers en vergeleken met dat in inheemse nieren (controle). Kwantitatieve analyse bevestigde dat weefsel genomisch DNA bijna werd geëlimineerd na decellularisatie. Uit 14 gevallen was de gemiddeld...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Dit protocol introduceert een methode om een steiger te ontwikkelen met behulp van gedecellulariseerde rattennieren. Het protocol omvat decellularisatie- en recellularisatieprocessen om de biologische beschikbaarheid te bevestigen. Decellularisatie wordt uitgevoerd met Triton X-100 en natriumdodecylsulfaat.

Voorbereiding van gedecellulariseerde niersteigers bij ratten

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

Dit protocol maakt het mogelijk om gevasculariseerde steigers te ontwikkelen met behulp van nieren in een rattenmodel. De nier is het meest geschikte orgaan voor steigers van gedifferentieerde stamcellen. Dit is een zeer succesvol protocol voor decellularisatie van de nier.Het verwijdert effectief de kernen met minimale vernietiging van de ECM-ultrastructuur. Deze techniek kan worden toegepast op transplantatiegeneeskunde en weefseltechniek. Kim Joo Hyoung, een MD/PhD universitair hoofddocent plastische chirurgie van mijn laboratorium, demonstreert de procedure.Plaats om te beginnen de acht weken oude Sprague Dawley-rat op een verwarmingskussen en plaats een rectale thermometersonde in het rectum om de kerntemperatuur te controleren. Nadat u de rat hebt verdoofd, plaatst u deze in een liggende positie en zet u de vier ledematen met tape op tafel. Scheer en reinig de buik met kiemdodende zeep.Breng 2%Betadine aan gedurende ten minste één tot twee minuten en veeg het vervolgens af met een 70% ethanoloplossing. Herhaal deze reeks drie keer. Bedek het operatieveld met een steriel, fenestrated laken.Maak een verticale abdominale incisie en stel de linkernier, ureter, abdominale aorta en inferieure vena cava bloot. Ontleed het weefsel net voor het snijden van de pedikel. Bereid 50 milliliter perfusieoplossing per rat door PBS te mengen met ongeveer 10 eenheden per milliliter heparine.Meng gelijke volumes van 8%PFA met PBS om de 4%PFA oplossing te maken. Verleng de verticale buikincisie cranially, zorg ervoor dat u de schaar weg te trekken van de organen bij het snijden om schade te voorkomen. Ga verder met de incisie door de ribbenkast en snijd vervolgens door het middenrif door het borstbeen op te tillen.Trek de losse flap van de huid uit de weg met een Allis-klem en bevrijd het hart door elk bindweefsel met de tang te scheuren. Open de PBS-lijn en zorg ervoor dat deze stroomt voordat u de naald in de linkerventrikel plaatst. Houd het hart voorzichtig vast met een stompe tang en gebruik een hemostase om de naald te bedienen.De naald mag niet meer dan een kwart inch worden ingebracht. Terwijl u het hart ondersteunt met de naald en hemostase, zoekt u het juiste atrium en knipt u er doorheen met een iridectomieschaar. Rust de hemostase op het lichaam van de rat en zorg ervoor dat de naald nog steeds in het hart is geplaatst.Blijf PBS gedurende vier minuten of langer perfusing als er nog bloed zichtbaar is in de nieren en lever. Oogst de linker nier met de abdominale aorta en inferieure vena cava. Ligateer de ureter, thoracale aorta, superieure vena cava en takken van de abdominale aorta.Houd het orgaan gehydrateerd in DPBS in een Petrischaal van 10 centimeter. Cannulate de abdominale aorta en inferieure vena cava met een 23-gauge katheter. Om restbloed te verwijderen, verbindt u de canule met een peristaltische pomp en wast u het orgaan met 500 milliliter DPBS en 16 eenheden per milliliter heparine gedurende 90 minuten bij vijf tpm en 37 graden Celsius.Om de nier te decellulariseren, perfuseer deze met 1%Triton X-100 gedurende drie uur en vervolgens met 0,75% SDS-oplossing gedurende zes uur bij een constante druk van 40 milliliter kwik. Om resterende SDS te verwijderen, perfuseert u het monster gedurende 18 uur met 1% penicilline in gedestilleerd water en vervolgens gedurende 90 minuten met steriele DPBS en 16 eenheden per milliliter heparine. De grove morfologie van rattennieren was donkerrood.Na decellularisatie werd de nier bleek en doorschijnend. Restgenomic DNA werd gekwantificeerd in gedecellulariseerde niersteigers en vergeleken met dat in inheemse nieren, wat bevestigt dat weefsel genomisch DNA bijna werd geëlimineerd na decellularisatie. Uit 14 gevallen was de gemiddelde DNA-inhoud 115,05 nanogram per microliter voor de besturing en 1,96 nanogram per microliter voor de gedecellulariseerde steiger.In totaal werd 98,3% van het DNA verwijderd. De driedimensionale structuur werd gehandhaafd en acellulaire glomeruli werden bewaard in het corticale parenchym. Wanneer u de naald in de linkerventrikel steekt, mag deze niet meer dan een kwart inch worden ingebracht.Elke verdere invoeging kan aan de andere kant uitkomen. We hebben er vertrouwen in dat deze techniek een nieuw perspectief zal openen op het gebied van weefseltechnologie.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute Myocardial Infarction in Rats

Acuut myocardinfarct in ratten

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotope dunne darm bij ratten

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Orthotopic Liver Transplantation in Rats

Orthotope levertransplantatie bij ratten

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Evaluatie van de vaatfunctie bij patiënten met chronische nierziekte

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Murine Kidney Transplant Technique

Muizen Niertransplantatie Techniek

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotherme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Nier Perfusie voor het Behoud van de Nier transplantaten voorafgaand aan de transplantatie

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Histologische kwantificering van chronische hartinfarct bij ratten

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Beoordeling van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Bloedplaatjes gebaseerde detectie van stikstofmonoxide in bloed door het meten van VASP fosforylatie

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

One-anastomosis Gastric Bypass (OAGB) in Rats

One-anastomosis Gastric Bypass OAGB in Rats

Één-wapendrager maagomleiding (OAGB) bij ratten

The goal of this protocol is to set up a preclinical model of bariatric surgery and, more specifically, OAGB in obese rats. Based on this preclinical ...