Name: preparation of decellularized kidney scaffolds in rats
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00
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Cette étude a été soutenue par une subvention de l’Institut de recherche biomédicale de l’hôpital universitaire national de Pusan.

Cette étude a été approuvée par l’administration de l’Université nationale de médecine de Pusan et a été menée conformément aux directives éthiques pour l’utilisation et les soins des animaux. (certificat no 2017-119). Avant toute étude sur les animaux, l’approbation de l’établissement doit être obtenue. NOTA : Tous les instruments, équipements et réactifs chirurgicaux et anesthésiques recommandés pour une présentation chirurgicale et une imagerie réussies des organes abdominaux sont dét...

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	<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression.">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li><li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering.">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li><li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering.">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li><li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+amniotic+membrane+(AM)+denuding+for+tissue+engineering.">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels.">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).</li><li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle;+implications+for+muscle+tissue+engineering.">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+definition+of+regenerative+medicine.">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li></ol>

Divers protocoles ont été utilisés pour la décellularisation des organes et d’autres tissus. Le protocole de décellularisation optimal devrait préserver l’architecture tridimensionnelle de la matrice extracellulaire (ECM). En général, de tels protocoles consistent à lyser la membrane cellulaire par traitement physique ou par solutions ioniques, à dissocier le cytoplasme et le noyau de l’ECM par traitement enzymatique ou détergents, puis à éliminer les débris cellulaires du tissu3.</s...

Les techniques de culture cellulaire sont appliquées pour la régénération des tissus et organes fonctionnels afin de remplacer les organes malades ou endommagés. La transplantation d’organes allogéniques est actuellement le traitement le plus courant pour les dommages irréversibles aux organes; cependant, cette approche exige l’utilisation de l’immunosuppression pour empêcher le rejet de l’organe transplanté. De plus, malgré les progrès de l’immunologie de la transplantation, 20% des greffés peuvent subir un rejet aigu dans les 5 ans, et dans les 10 ans suivant la transplantation, 40% des receveurs peuvent perdre leur greffe transplantée ou mourir1.
Les progrès des technologies d’ingénierie tissulaire ont donné lieu à un nouveau paradigme pour la transplantation de nouveaux organes sans rejet immunitaire à l’aide de cellules souches différenciées. Après la différenciation des cellules souches, un échafaudage, appelé matrice extracellulaire synthétique, est nécessaire pour faciliter la génération d’organes tridimensionnels et permettre au nouveau tissu de prospérer chez le receveur. Les échafaudages d’organes natifs décellulaires présentent des avantages, notamment un environnement plus efficace pour l’établissement de cellules et l’amélioration de la prolifération des cellules souches, bien que ces mécanismes n’aient pas été entièrement élucularisés2. En particulier, le rein est un organe approprié pour la génération d’échafaudages car il a une circulation abondante et une niche pour l’établissement de cellules souches. De plus, en raison de la structure complexe du rein, il est difficile de régénérer artificiellement les reins pour la transplantation d’organes.
Dans ce rapport, nous introduisons une méthode de développer des échafaudages vascularisés utilisant les organes decellularized dans un modèle de rat pour faciliter de futures études animales à des fins d’ingénierie tissulaire.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 ethilon for vessel anastomosis</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>9032G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 PDS incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z316H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Prolene incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8832H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk spool vascular access/ligation in rat</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 PDS incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z773D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Prolene incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8831H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors to cut fascia/connective tissue</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>.023&#34; &#215; .038&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz microserrefine vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01 (straight)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18052-03 (curved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors to cut skin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of decellularized kidney scaffolds in rats

Le génie tissulaire est une discipline de pointe en biomédecine. Des techniques de culture cellulaire peuvent être appliquées pour la régénération des tissus et organes fonctionnels afin de remplacer les organes malades ou endommagés. Des échafaudages sont nécessaires pour faciliter la génération d’organes ou de tissus tridimensionnels à l’aide de cellules souches différenciées in vivo. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode originale pour développer des échafaudages vascularisés utilisant les reins decellularized de rat. Huit semaines-vieux rats de Sprague-Dawley ont été utilisés dans cette étude, et l’héparine a été injectée dans le coeur pour faciliter l’écoulement dans les navires rénaux, permettant à l’héparine de perfuser dans les navires rénaux. La cavité abdominale a été ouverte, et le rein gauche a été rassemblé. Les reins collectés ont été perfusés pendant 9 h utilisant des détergents, tels que Triton X-100 et le sulfate de dodécyle de sodium, pour décellulariser le tissu. Des échafaudages décellulaires de rein ont été alors doucement lavés avec 1% de pénicilline/streptomycine et d’héparine pour enlever les débris cellulaires et les résidus chimiques. On s’attend à ce que la transplantation de cellules souches avec les échafaudages vasculaires décellulaires facilite la génération de nouveaux organes. Ainsi, les échafaudages vascularisés peuvent fournir une base pour l’ingénierie tissulaire des greffes d’organe à l’avenir.

La morphologie brute des reins de rat était rouge foncé (figure 1A). Après la décellularisation, le rein est devenu pâle et translucide(figure 1D). L’ADN génomique résiduel a été évalué à l’utilisation d’une trousse commerciale conformément aux instructions du fabricant, dans des échafaudages rénaux décellulaires et comparé à celui des reins natifs (témoins). L’analyse quantitative a confirmé que l’ADN génomique des tissus était p...

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Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Ce protocole introduit une méthode pour développer un échafaudage utilisant les reins de rat décellulaires. Le protocole comprend des processus de décellularisation et de recellularisation pour confirmer la biodisponibilité. La décellularisation est réalisée à l’aide de Triton X-100 et de dodécyl sulfate de sodium.

Préparation d’échafaudages rénaux décellulaires chez le rat

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

Ce protocole permet de développer des échafaudages vascularisés à l’aide de reins dans un modèle de rat. Le rein est l’organe le plus approprié pour les échafaudages de cellules souches différenciées. C’est un protocole très réussi pour la décellularisation du rein.Il élimine efficacement les noyaux avec une destruction minimale de l’ultrastructure ECM. Cette technique peut être appliquée à la médecine de transplantation et à l’ingénierie tissulaire. Kim Joo Hyoung, professeur agrégé de chirurgie plastique de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour commencer, placez le rat Sprague Dawley âgé de huit semaines sur un coussin chauffant et placez une sonde thermométrique rectale dans le rectum pour surveiller la température centrale. Après avoir anesthésié le rat, placez-le en décubitus dorsal et fixez les quatre membres à la table avec du ruban adhésif. Rasez et nettoyez l’abdomen avec du savon germicide.Appliquez 2% de bétadine pendant au moins une à deux minutes, puis essuyez-la avec une solution d’éthanol à 70%. Répétez cette séquence trois fois. Couvrez le champ opératoire avec un drapé stérile et fenêtré.Faites une incision abdominale verticale et exposez le rein gauche, l’uretère, l’aorte abdominale et la veine cave inférieure. Disséquer le tissu juste avant de couper le pédicule. Préparer 50 millilitres de solution de perfusion par rat en mélangeant du PBS avec environ 10 unités par millilitre d’héparine.Mélanger des volumes égaux de 8% PFA avec PBS pour faire la solution 4% PFA. Étendre l’incision abdominale verticale de manière crânienne, en vous assurant de retirer les ciseaux des organes lors de la coupe pour éviter tout dommage. Continuez l’incision à travers la cage thoracique, puis coupez à travers le diaphragme en soulevant le sternum.Rétractez le lambeau lâche de la peau à l’écart avec une pince Allis et libérez le cœur en déchirant tout tissu conjonctif avec la pince. Ouvrez la ligne PBS et assurez-vous qu’elle coule avant de placer l’aiguille dans le ventricule gauche. Tenez doucement le cœur avec une pince émoussée et utilisez un hémostatique pour contrôler l’aiguille.L’aiguille ne doit pas être insérée plus d’un quart de pouce. Tout en soutenant le cœur avec l’aiguille et l’hémostatique, localisez l’oreillette droite et passez-y un coup de ciseaux iridectomy. Reposez l’hémostatique sur le corps du rat et assurez-vous que l’aiguille est toujours positionnée à l’intérieur du cœur.Continuer à perfuser le PBS pendant quatre minutes ou plus s’il y a encore du sang visible dans les reins et le foie. Récoltez le rein gauche avec l’aorte abdominale et la veine cave inférieure. Ligate l’uretère, l’aorte thoracique, la veine cave supérieure, et les branches de l’aorte abdominale.Gardez l’organe hydraté dans le DPBS dans une boîte de Petri de 10 centimètres. Canule l’aorte abdominale et la veine cave inférieure avec un cathéter de calibre 23. Pour enlever le sang résiduel, connectez la canule avec une pompe péristaltique et lavez l’organe avec 500 millilitres de DPBS et 16 unités par millilitre d’héparine pendant 90 minutes à cinq tours et 37 degrés Celsius.Pour décellulariser le rein, perfuser avec 1% Triton X-100 pendant trois heures, puis avec une solution SDS à 0,75% pendant six heures à une pression constante de 40 millilitres de mercure. Pour éliminer les FDS résiduelles, perfuser l’échantillon avec 1 % de pénicilline dans de l’eau distillée pendant 18 heures, puis avec du DPBS stérile et 16 unités par millilitre d’héparine pendant 90 minutes. La morphologie brute des reins de rat était rouge foncé.Après la décellularisation, le rein est devenu pâle et translucide. L’ADN génomique résiduel a été quantifié dans des échafaudages rénaux décellulaires et comparé à celui dans les reins natifs, confirmant que l’ADN génomique tissulaire a été presque éliminé après la décellularisation. Sur 14 cas, les teneurs moyennes en ADN étaient de 115,05 nanogrammes par microlitre pour le témoin et de 1,96 nanogramme par microlitre pour l’échafaudage décellulaire.Au total, 98,3 % de l’ADN a été prélevé. La structure tridimensionnelle a été maintenue, et des glomérules acellulaires ont été préservés dans le parenchyme cortical. Lors de l’insertion de l’aiguille dans le ventricule gauche, elle ne doit pas être insérée plus d’un quart de pouce.Toute autre insertion peut sortir de l’autre côté. Nous sommes convaincus que cette technique ouvrira une nouvelle perspective dans le domaine de l’ingénierie tissulaire.

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