Name: preparation of decellularized kidney scaffolds in rats
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00
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Diese Studie wurde durch ein Biomedical Research Institute Grant des Pusan National University Hospital unterstützt.

Diese Studie wurde von der Verwaltung der Pusan National University of Medicine genehmigt und in Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Tieren durchgeführt. (Zertifikat Nr. 2017-119). Vor jeder Tierstudie sollte eine institutionelle Genehmigung eingeholt werden. HINWEIS: Alle chirurgischen und anästhetischen Instrumente/Geräte und Reagenzien, die für eine erfolgreiche chirurgische Präsentation und Bildgebung von Bauchorganen empfohlen werden, sind in Tabelle 1 aufgef...

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	<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression.">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li><li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering.">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li><li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering.">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li><li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+amniotic+membrane+(AM)+denuding+for+tissue+engineering.">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels.">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).</li><li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle;+implications+for+muscle+tissue+engineering.">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+definition+of+regenerative+medicine.">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li></ol>

Verschiedene Protokolle wurden für die Dezellularisierung von Organen und anderen Geweben verwendet. Das optimale Dezellularisierungsprotokoll sollte die dreidimensionale Architektur der extrazellulären Matrix (ECM) erhalten. Im Allgemeinen bestehen solche Protokolle darin, die Zellmembran durch physikalische Verarbeitung oder ionische Lösungen zu lysieren, das Zytoplasma und den Zellkern durch enzymatische Verarbeitung oder Reinigungsmittel aus dem ECM zu dissoziieren und dann Zelltrümmer aus dem Gewebe zu entfernen...

Zellkulturtechniken werden zur Regeneration von funktionellen Geweben und Organen eingesetzt, um kranke oder beschädigte Organe zu ersetzen. Allogene Organtransplantation ist derzeit die häufigste Behandlung für irreversible Organschäden; Dieser Ansatz erfordert jedoch die Verwendung von Immunsuppression, um eine Abstoßung des transplantierten Organs zu verhindern. Darüber hinaus können trotz Fortschritten in der Transplantimmunologie 20% der Transplantatempfänger innerhalb von 5 Jahren eine akute Abstoßung erfahren, und innerhalb von 10 Jahren nach der Transplantation können 40% der Empfänger ihr transplantiertes Transplantat verlieren oder sterben1.
Fortschritte in den Tissue-Engineering-Technologien haben zu einem neuen Paradigma für die Transplantation neuer Organe ohne Immunabstoßung mit differenzierten Stammzellen geführt. Nach der Stammzelldifferenzierung wird ein Gerüst, eine synthetische extrazelluläre Matrix genannt, benötigt, um die Erzeugung dreidimensionaler Organe zu erleichtern und das neue Gewebe im Empfänger gedeihen zu lassen. Gerüste aus dezellularisierten nativen Organen haben Vorteile, einschließlich einer effektiveren Umgebung für die Etablierung von Zellen und die Verbesserung der Stammzellproliferation, obwohl diese Mechanismen nicht vollständig aufgeklärt wurden2. Insbesondere die Niere ist ein geeignetes Organ für die Gerüstbildung, da sie eine reichliche Zirkulation und eine Nische für die Stammzellbildung aufs neuethält. Darüber hinaus ist es aufgrund der komplexen Struktur der Niere schwierig, Nieren für die Organtransplantation künstlich zu regenerieren.
In diesem Bericht stellen wir eine Methode zur Entwicklung vaskularisierter Gerüste unter Verwendung dezellularisierter Organe in einem Rattenmodell vor, um zukünftige Tierversuche für Tissue Engineering-Zwecke zu erleichtern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 ethilon for vessel anastomosis</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>9032G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 PDS incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z316H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Prolene incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8832H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk spool vascular access/ligation in rat</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 PDS incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z773D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Prolene incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8831H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors to cut fascia/connective tissue</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>.023&#34; &#215; .038&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz microserrefine vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01 (straight)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18052-03 (curved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors to cut skin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of decellularized kidney scaffolds in rats

Tissue Engineering ist eine Spitzendisziplin in der Biomedizin. Zellkulturtechniken können zur Regeneration von funktionellen Geweben und Organen angewendet werden, um kranke oder beschädigte Organe zu ersetzen. Gerüste werden benötigt, um die Erzeugung dreidimensionaler Organe oder Gewebe mit differenzierten Stammzellen in vivo zu erleichtern. In diesem Bericht beschreiben wir eine neuartige Methode zur Entwicklung vaskularisierter Gerüste mit dezellularisierten Rattennieren. Acht Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten wurden in dieser Studie verwendet, und Heparin wurde in das Herz injiziert, um den Fluss in die Nierengefäße zu erleichtern, so dass Heparin in die Nierengefäße eindringen konnte. Die Bauchhöhle wurde geöffnet und die linke Niere wurde gesammelt. Die gesammelten Nieren wurden 9 h lang mit Reinigungsmitteln wie Triton X-100 und Natriumdodecylsulfat perfundiert, um das Gewebe zu dezellulieren. Dezellularisierte Nierengerüste wurden dann sanft mit 1% Penicillin / Streptomycin und Heparin gewaschen, um Zelltrümmer und chemische Rückstände zu entfernen. Die Transplantation von Stammzellen mit den dezellularisierten Gefäßgerüsten soll die Erzeugung neuer Organe erleichtern. So könnten die vaskularisierten Gerüste in Zukunft eine Grundlage für das Tissue Engineering von Organtransplantaten bilden.

Die grobe Morphologie der Rattennieren war dunkelrot (Abbildung 1A). Nach der Dezellularisierung wurde die Niere blass und durchscheinend (Abbildung 1D). Restgenomische DNA wurde mit einem handelsüblichen Kit nach Herstellerangaben in dezellularisierten Nierengerüsten bewertet und mit denen in nativen Nieren verglichen (Kontrolle). Quantitative Analysen bestätigten, dass die genomische DNA des Gewebes nach der Dezellularisierung fast eliminiert wurde. Von 14 ...

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Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Dieses Protokoll führt eine Methode zur Entwicklung eines Gerüsts mit dezellularisierten Rattennieren ein. Das Protokoll umfasst Dezellularisierungs- und Rezellularisierungsprozesse, um die Bioverfügbarkeit zu bestätigen. Die Dezellularisierung wird mit Triton X-100 und Natriumdodecylsulfat durchgeführt.

Herstellung von dezellularisierten Nierengerüsten bei Ratten

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, vaskularisierte Gerüste mit Nieren in einem Rattenmodell zu entwickeln. Die Niere ist das am besten geeignete Organ für Gerüste aus differenzierten Stammzellen. Dies ist ein sehr erfolgreiches Protokoll zur Dezellularisierung der Niere.Es entfernt effektiv die Kerne mit minimaler Zerstörung der ECM-Ultrastruktur. Diese Technik kann auf die Transplantationsmedizin und das Tissue Engineering angewendet werden. Das Verfahren wird kim Joo Hyoung, md / PhD associate professor für plastische Chirurgie aus meinem Labor, demonstrieren.Legen Sie zunächst die acht Wochen alte Sprague Dawley-Ratte auf ein Wärmepad und positionieren Sie eine rektale Thermometersonde im Rektum, um die Kerntemperatur zu überwachen. Nachdem Sie die Ratte betäubt haben, legen Sie sie in Rückenlage und befestigen Sie die vier Gliedmaßen mit Klebeband am Tisch. Rasieren und reinigen Sie den Bauch mit keimtötiger Seife.Tragen Sie 2% Betadin für mindestens ein bis zwei Minuten auf und wischen Sie es dann mit einer 70% igen Ethanollösung ab. Wiederholen Sie diese Sequenz dreimal. Decken Sie das Operationsfeld mit einem sterilen, fenestrierten Vorhang ab.Machen Sie einen vertikalen Bauchschnitt und legen Sie die linke Niere, den Harnleiter, die Bauchaorta und die Untervene frei. Sezieren Sie das Gewebe kurz vor dem Schneiden des Pedikels. Bereiten Sie 50 Milliliter Perfusionslösung pro Ratte vor, indem Sie PBS mit etwa 10 Einheiten pro Milliliter Heparin mischen.Mischen Sie gleiche Mengen von 8% PFA mit PBS, um die 4% PFA-Lösung herzustellen. Verlängern Sie den vertikalen Bauchschnitt kranial und stellen Sie sicher, dass Sie die Schere beim Schneiden von den Organen wegziehen, um Schäden zu vermeiden. Setzen Sie den Schnitt durch den Brustkorb fort und schneiden Sie dann durch das Zwerchfell, indem Sie das Brustbein anheben.Ziehen Sie den losen Hautlappen mit einer Allis-Klemme aus dem Weg und befreien Sie das Herz, indem Sie das Bindegewebe mit der Zange reißen. Öffnen Sie die PBS-Leitung und stellen Sie sicher, dass sie fließt, bevor Sie die Nadel in den linken Ventrikel legen. Halten Sie das Herz sanft mit einer stumpfen Zette und verwenden Sie einen Hämostat, um die Nadel zu kontrollieren.Die Nadel sollte nicht mehr als einen Viertelzoll eingeführt werden. Während Sie das Herz mit der Nadel und dem Hämostat unterstützen, lokalisieren Sie den rechten Vorhof und schneiden Sie ihn mit einer Iridektomieschere durch. Ruhen Sie den Hämostat auf den Körper der Ratte und stellen Sie sicher, dass die Nadel noch im Herzen positioniert ist.Setzen Sie die Infusion von PBS für vier Minuten oder länger fort, wenn noch Blut in der Niere und Leber sichtbar ist. Ernten Sie die linke Niere mit der Bauchaorta und der unteren Hohlvene. Ligatieren Sie den Harnleiter, die thorakale Aorta, die obere Hohlvene und die Äste der Bauchaorta.Halten Sie das Organ in DPBS in einer 10 Zentimeter petri-Schale hydratisiert. Kanellieren Sie die Bauchaorta und die Vena cava inferior mit einem 23-Gauge-Katheter. Um Restblut zu entfernen, verbinden Sie die Kanüle mit einer Peristaltikpumpe und waschen Sie das Organ mit 500 Millilitern DPBS und 16 Einheiten pro Milliliter Heparin für 90 Minuten bei fünf U / min und 37 Grad Celsius.Um die Niere zu dezellulieren, pergieren Sie sie drei Stunden lang mit 1% Triton X-100 und dann mit 0,75% SDS-Lösung für sechs Stunden bei einem konstanten Druck von 40 Millilitern Quecksilber. Um Rest-SDS zu entfernen, perpergieren Sie die Probe mit 1% Penicillin in destilliertem Wasser für 18 Stunden und dann mit sterilem DPBS und 16 Einheiten pro Milliliter Heparin für 90 Minuten. Die grobe Morphologie der Rattennieren war dunkelrot.Nach der Dezellularisierung wurde die Niere blass und durchscheinend. Restgenomische DNA wurde in dezellularisierten Nierengerüsten quantifiziert und mit der in nativen Nieren verglichen, was bestätigte, dass die genomische DNA des Gewebes nach der Dezellularisierung fast eliminiert wurde. Von 14 Fällen betrug der durchschnittliche DNA-Gehalt 115,05 Nanogramm pro Mikroliter für die Kontrolle und 1,96 Nanogramm pro Mikroliter für das dezellularisierte Gerüst.Insgesamt wurden 98,3% der DNA entfernt. Die dreidimensionale Struktur wurde beibehalten und azelluläre Glomeruli wurden im kortikalen Parenchym erhalten. Wenn Sie die Nadel in den linken Ventrikel einführen, sollte sie nicht mehr als einen Viertelzoll eingeführt werden.Jede weitere Einfügung kann auf der anderen Seite herauskommen. Wir sind zuversichtlich, dass diese Technik eine neue Perspektive im Bereich des Tissue Engineering eröffnen wird.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute Myocardial Infarction in Rats

Akuter Myokardinfarkt bei Ratten

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Forschung

Medizin

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopen Dünndarm Transplantation in Ratten

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Orthotopic Liver Transplantation in Rats

Lebertransplantation bei der Ratte

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Beurteilung der Gefäßfunktion bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Murine Kidney Transplant Technique

Murine Nierentransplantations Technik

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kidney Perfusion für die Erhaltung der Nierentransplantate vor der Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Die histologische Quantifizierung der chronischen Myokardinfarktes bei Ratten

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Thrombozyten-basierte Erkennung von Stickoxid im Blut durch die Messung VASP Phosphorylierung

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

One-anastomosis Gastric Bypass (OAGB) in Rats

One-anastomosis Gastric Bypass OAGB in Rats

Eine Anastomose Magenbypass (OAGB) bei Ratten

The goal of this protocol is to set up a preclinical model of bariatric surgery and, more specifically, OAGB in obese rats. Based on this preclinical ...