Name: preparation of decellularized kidney scaffolds in rats
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00
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Questo studio è stato supportato da una borsa di studio del Biomedical Research Institute del Pusan National University Hospital.

Questo studio è stato approvato dalla somministrazione della Pusan National University of Medicine ed è stato condotto in conformità con le linee guida etiche per l'uso e la cura degli animali. (certificato n. 2017-119). Prima di qualsiasi studio sugli animali, dovrebbe essere ottenuta l'approvazione istituzionale. NOTA: Tutti gli strumenti/attrezzature chirurgiche e anestetiche e i reagenti raccomandati per una presentazione chirurgica di successo e l'imaging di organi addominali sono dettagliati nella tab...

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	<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression.">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li><li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering.">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li><li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering.">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li><li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+amniotic+membrane+(AM)+denuding+for+tissue+engineering.">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels.">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).</li><li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle;+implications+for+muscle+tissue+engineering.">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+definition+of+regenerative+medicine.">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li></ol>

Vari protocolli sono stati utilizzati per la decellularizzazione di organi e altri tessuti. Il protocollo di decellularizzazione ottimale deve preservare l'architettura tridimensionale della matrice extracellulare (ECM). In generale, tali protocolli consistono nel lisciviare la membrana cellulare mediante elaborazione fisica o soluzioni ioniche, dissociare il citoplasma e il nucleo dall'ECM mediante lavorazione enzimatica o detergenti, quindi rimuovere i detriti cellulari dal tessuto3. I processi ...

Le tecniche di coltura cellulare sono applicate per la rigenerazione di tessuti e organi funzionali per sostituire gli organi matti o danneggiati. Il trapianto di organi allogenici è attualmente il trattamento più comune per danni irreversibili agli organi; tuttavia, questo approccio richiede l'uso di immunosoppressione per prevenire il rigetto dell'organo trapiantato. Inoltre, nonostante i progressi nell'immunologia dei trapianti, il 20% dei riceventi di trapianti può sperimentare un rigetto acuto entro 5 anni e, entro 10 anni dal trapianto, il 40% dei riceventi può perdere l'innesto trapiantato o morire1.
I progressi nelle tecnologie di ingegneria tissutale hanno prodotto un nuovo paradigma per il trapianto di nuovi organi senza rigetto immunitario utilizzando cellule staminali differenziate. Dopo la differenziazione delle cellule staminali, è necessaria un'impalcatura, chiamata matrice extracellulare sintetica, per facilitare la generazione di organi tridimensionali e consentire al nuovo tessuto di prosperare all'interno del ricevente. Le impalcature provenienti da organi nativi decellularizzati hanno vantaggi, tra cui un ambiente più efficace per la creazione di cellule e il miglioramento della proliferazione delle cellule staminali, sebbene questi meccanismi non siano stati completamente chiariti2. In particolare, il rene è un organo adatto per la generazione di impalcature perché ha una circolazione abbondante e una nicchia per lo stabilimento delle cellule staminali. Inoltre, a causa della complessa struttura del rene, è difficile rigenerare artificialmente i reni per il trapianto di organi.
In questa relazione introduciamo un metodo per sviluppare impalcature vascolarizzate utilizzando organi decellularizzati in un modello di ratto per facilitare futuri studi sugli animali a fini di ingegneria tissutale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 ethilon for vessel anastomosis</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>9032G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 PDS incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z316H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Prolene incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8832H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk spool vascular access/ligation in rat</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 PDS incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z773D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Prolene incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8831H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors to cut fascia/connective tissue</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>.023&#34; &#215; .038&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz microserrefine vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01 (straight)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18052-03 (curved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors to cut skin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of decellularized kidney scaffolds in rats

L'ingegneria tissutale è una disciplina all'avanguardia in biomedicina. Le tecniche di coltura cellulare possono essere applicate per la rigenerazione di tessuti e organi funzionali per sostituire gli organi matti o danneggiati. Le impalcature sono necessarie per facilitare la generazione di organi o tessuti tridimensionali utilizzando cellule staminali differenziate in vivo. In questa relazione descriviamo un nuovo metodo per lo sviluppo di impalcature vascolarizzate che utilizzano reni di ratto decellularizzati. In questo studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley di otto settimane, ed l'eparina è stata iniettata nel cuore per facilitare il flusso nei vasi renali, permettendo all'eparina di perfondersi nei vasi renali. La cavità addominale è stata aperta e il rene sinistro è stato raccolto. I reni raccolti sono stati perfusi per 9 ore usando detergenti, come Triton X-100 e solfato di dodecil di sodio, per decellularizzare il tessuto. Le impalcature renali decellularizzate sono state poi lavate delicatamente con l'1% di penicillina/streptomicina ed eparina per rimuovere detriti cellulari e residui chimici. Il trapianto di cellule staminali con le impalcature vascolari decellularizzate dovrebbe facilitare la generazione di nuovi organi. Pertanto, le impalcature vascolarizzate possono fornire una base per l'ingegneria tissutale degli innesti di organi in futuro.

La morfologia grossolana dei reni del ratto era rosso scuro(figura 1A). Dopo la decellularizzazione, il rene è diventato pallido e traslucido (Figura 1D). Il DNA genomico residuo è stato valutato con un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore, in impalcature renali decellularizzate e confrontato con quello nei reni nativi (controllo). L'analisi quantitativa ha confermato che il DNA genomico tissutale è stato quasi eliminato dopo la decellularizza...

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Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Questo protocollo introduce un metodo per sviluppare un'impalcatura utilizzando reni di ratto decellularizzati. Il protocollo include processi di decellularizzazione e ricellularizzazione per confermare la biodisponibilità. La decellularizzazione viene eseguita utilizzando Tritone X-100 e solfato di dodecil di sodio.

Preparazione di impalcature renali decellularizzate nei ratti

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

Questo protocollo consente di sviluppare impalcature vascolarizzate utilizzando reni in un modello di ratto. Il rene è l'organo più adatto per impalcature di cellule staminali differenziate. Questo è un protocollo di grande successo per la decellularizzazione del rene.Rimuove efficacemente i nuclei con la minima distruzione dell'ultrastruttura ECM. Questa tecnica può essere applicata alla medicina dei trapianti e all'ingegneria tissutale. A dimostrare la procedura sarà Kim Joo Hyoung, professore associato di chirurgia plastica del mio laboratorio.Per iniziare, posizionare il ratto Sprague Dawley di otto settimane su un tampone riscaldante e posizionare una sonda termometro rettale nel retto per monitorare la temperatura interna. Dopo aver anestetizzato il topo, posizionarlo in posizione supina e fissare i quattro arti al tavolo con del nastro adesivo. Radere e pulire l'addome con sapone germicida.Applicare il 2%Betadine per almeno uno o due minuti, quindi pulirlo con una soluzione di etanolo al 70%. Ripetere questa sequenza tre volte. Coprire il campo operatorio con un drappo sterile e fenestrato.Fai un'incisione addominale verticale ed esponi il rene sinistro, l'utere, l'aorta addominale e la vena cava inferiore. Sezionare il tessuto poco prima di tagliare il pedicolo. Preparare 50 millilitri di soluzione perfusione per ratto mescolando PBS con circa 10 unità per millilitro eparina.Mescola volumi uguali dell'8%PFA con PBS per creare la soluzione PFA al 4%. Estendere l'incisione addominale verticale cranicamente, assicurandosi di disegnare le forbici lontano dagli organi durante il taglio per evitare danni. Continuare l'incisione attraverso la gabbia toracica, quindi tagliare attraverso il diaframma sollevando lo sterno.Ritrai il lembo sciolto della pelle con un morsetto Allis e libera il cuore strappando qualsiasi tessuto connettivo con le pinze. Aprire la linea PBS e assicurarsi che fluisco prima di posizionare l'ago nel ventricolo sinistro. Tenere delicatamente il cuore con pini smussati e utilizzare un emostato per controllare l'ago.L'ago deve essere inserito non più di un quarto di pollice. Mentre si sostiene il cuore con l'ago e l'emostato, individuare l'atrio destro e tagliarlo attraverso di esso con forbici per iridectomia. Appoggia l'emostato sul corpo del topo e assicurati che l'ago sia ancora posizionato all'interno del cuore.Continuare a perfondere PBS per quattro minuti o più se c'è ancora sangue visibile nel rene e nel fegato. Raccogliere il rene sinistro con l'aorta addominale e la vena cava inferiore. Ligate l'urigatore, l'aorta toracica, la vena cava superiore e i rami dell'aorta addominale.Mantenere l'organo idratato in DPBS in una piastra di Petri di 10 centimetri. Cannulate l'aorta addominale e la vena cava inferiore con un catetere calibro 23. Per rimuovere il sangue residuo, collegare la cannula con una pompa peristaltica e lavare l'organo con 500 millilitri di DPBS e 16 unità per millilitro eparina per 90 minuti a cinque giri/min e 37 gradi Celsius.Per decellularizzare il rene, perfonderlo con 1%Triton X-100 per tre ore e quindi con una soluzione di SDS dello 0,75% per sei ore a una pressione costante di 40 millilitri di mercurio. Per rimuovere l'SDS residuo, perfondere il campione con 1%penicillina in acqua distillata per 18 ore e quindi con DPBS sterile e 16 unità per millilitro eparina per 90 minuti. La morfologia grossolana dei reni del ratto era rosso scuro.Dopo la decellularizzazione, il rene divenne pallido e traslucido. Il DNA genomico residuo è stato quantificato in impalcature renali decellularizzate e confrontato con quello dei reni nativi, confermando che il DNA genomico tissutale è stato quasi eliminato dopo la decellularizzazione. Da 14 casi, il contenuto medio di DNA era di 115,05 nanogrammi per microlitro per il controllo e 1,96 nanogrammi per microlitro per l'impalcatura decellularizzata.In totale, il 98,3% del DNA è stato rimosso. La struttura tridimensionale fu mantenuta, e i glomeruli acellulari furono conservati nel parenchima corticale. Quando si inserisce l'ago nel ventricolo sinistro, deve essere inserito non più di un quarto di pollice.Qualsiasi ulteriore inserimento può uscire dall'altra parte. Siamo confidiamo che questa tecnica aprirà una nuova prospettiva nel campo dell'ingegneria tissutale.

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