Name: preparation of decellularized kidney scaffolds in rats
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00
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이 연구는 부산대학교병원의 생물의학연구소 보조금에 의해 지원되었다.

이 연구는 부산국립의과대학의 행정에 의해 승인되었으며 동물의 사용과 관리에 대한 윤리적 지침에 따라 수행되었습니다. (인증서 번호 2017-119). 동물 연구에 앞서 제도적 승인을 받아야 합니다. 참고: 성공적인 수술 프리젠 테이션 및 복부 장기의 이미징에 권장되는 모든 수술 및 마취 기구 / 장비 및 시약은 표 1에자세히 설명되어 있습니다.
1. 쥐 신장 수확 준?...

<ol>
	<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression.">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li><li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering.">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li><li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering.">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li><li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+amniotic+membrane+(AM)+denuding+for+tissue+engineering.">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels.">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).</li><li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle;+implications+for+muscle+tissue+engineering.">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+definition+of+regenerative+medicine.">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li></ol>

기관 및 기타 조직의 세포 탈세포화에 다양한 프로토콜이 사용되었습니다. 최적의 탈세포화 프로토콜은 세포외 매트릭스(ECM)의 3차원 아키텍처를 보존해야 한다. 일반적으로, 이러한 프로토콜은 물리적 처리 또는 이온 용액에 의해 세포막을 용인하고, 효소 처리 또는 세제에 의해 ECM으로부터 세포질 과 핵을 해리한 다음, 조직3으로부터세포 이물질을 제거하는 것으로 구성된다. ...

세포 배양 기술은 질병또는 손상된 기관을 대체하기 위하여 기능적인 조직 및 기관의 재생을 위해 적용됩니다. 동종 성 장기 이식은 현재 돌이킬 수없는 장기 손상에 대한 가장 흔한 치료법입니다. 그러나, 이 접근법은 이식된 기관의 거부를 방지하기 위하여 면역 억제의 사용을 요구합니다. 더욱이, 이식 면역학에 있는 어드밴스에 있는 어드밴스에 도불구하고, 이식 수령인의 20%는 5 년 안에 심각한 거부를 경험할 수 있고, 이식 후에 10 년 안에, 수령인의 40%는 그들의 이식한 이식편을 분실하거나1을정지할 수 있습니다.
조직 공학 기술의 발전은 분화 된 줄기 세포를 사용하여 면역 거부없이 새로운 기관의 이식을위한 새로운 패러다임에서 산출했다. 줄기 세포 분화 후, 합성 세포 외 매트릭스라고 불리는 비계는 3 차원 장기의 생성을 용이하게하고 새로운 조직이 받는 사람 내에서 번창 할 수 있도록 하는 데 필요합니다. 탈세포 된 네이티브 장기에서 스캐폴드는 세포의 확립과 줄기 세포 증식의 향상을위한 보다 효과적인 환경을 포함하여 장점이 있지만 이러한 메커니즘은 완전히 해명되지 않았습니다2. 특히, 신장은 줄기세포 설립을 위한 풍부한 순환과 틈새 시장을 가지고 있기 때문에 스캐폴드 생성에 적합한 기관이다. 또한 신장의 복잡한 구조 로 인해 장기 이식을 위해 신장을 인위적으로 재생하기가 어렵습니다.
이 보고서에서는 조직 공학 을 위해 미래의 동물 연구를 용이하게하기 위해 쥐 모델에서 탈세포 기관을 사용하여 혈관으로 된 비계를 개발하는 방법을 소개합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 ethilon for vessel anastomosis</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>9032G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 PDS incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z316H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Prolene incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8832H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk spool vascular access/ligation in rat</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 PDS incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z773D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Prolene incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8831H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors to cut fascia/connective tissue</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>.023&#34; &#215; .038&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz microserrefine vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01 (straight)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18052-03 (curved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors to cut skin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of decellularized kidney scaffolds in rats

조직 공학은 생물 의학의 최첨단 분야입니다. 세포 배양 기술은 질병또는 손상된 기관을 대체하기 위하여 기능적인 조직 및 기관의 재생을 위해 적용될 수 있습니다. 비폴드는 생체 내에서 분화 된 줄기 세포를 사용하여 3 차원 기관 또는 조직의 생성을 용이하게하기 위해 필요합니다. 이 보고에서는, 우리는 탈세포쥐 신장을 사용하여 혈관 비계를 개발하기 위한 새로운 방법을 기술합니다. 8주된 스프라그-Dawley 쥐는 이 연구에서 사용되었고, 헤파린이 신장 혈관으로 유입되는 것을 용이하게 하기 위해 심장에 주입되어 헤파린이 신장 혈관으로 침투할 수 있게 했습니다. 복강이 열리고 왼쪽 신장이 수집되었습니다. 수집된 신장은 트리톤 X-100 및 나트륨 도데실 황산염과 같은 세제를 사용하여 9시간 동안 침투하여 조직을 탈세포화했다. 탈세포 신장 비계는 세포 파편 및 화학 잔류물을 제거하기 위해 1 % 페니실린 / 연쇄 상절제술 및 헤파린으로 부드럽게 세척되었습니다. 탈세포화된 혈관 비계를 가진 줄기 세포의 이식은 새로운 기관의 생성을 용이하게 할 것으로 예상된다. 따라서, 혈관비계는 미래에 장기 이식의 조직 공학을 위한 기초를 제공할 수 있다.

쥐 신장의 총 형태는 어두운 빨간색이었다(도 1A). 탈세포화 후 신장은 창백하고 반투명하게되었다(도 1D). 잔류 유전체 DNA는 제조업체의 지시에 따라 상용 키트로 평가되었으며, 세포탈신장 비계에서, 그리고 네이티브 신장(대조군)과 비교하였다. 정량 분석은 조직 게놈 DNA가 탈세포화 후에 거의 제거되었다는 것을 확인했습니다. 14건에서, 평균 DNA 함량...

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Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

이 프로토콜은 탈세포 쥐 신장을 사용하여 발판을 개발하는 방법을 소개합니다. 이 프로토콜에는 생체 이용률을 확인하기 위한 탈세포화 및 재세포화 프로세스가 포함됩니다. 탈세포화는 트리톤 X-100 및 나트륨 도데킬 황산염을 사용하여 수행됩니다.

쥐에 있는 세포탈구형 신장 비계의 준비

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

이 프로토콜은 쥐 모형에 있는 신장을 사용하여 혈관 비계를 개발하는 가능하게 합니다. 신장은 분화한 줄기 세포의 비계에 가장 적합한 기관입니다. 이것은 신장의 탈세포화를 위한 매우 성공적인 프로토콜입니다.ECM 초구조의 최소한의 파괴로 핵을 효과적으로 제거합니다. 이 기술은 이식 의학 및 조직 공학에 적용될 수 있습니다. 수술을 시연하는 것은 실험실에서 성형외과 의학과 김주형 교수입니다.먼저 8주된 스프라그 Dawley 쥐를 온난화 패드에 놓고 직장 온도계 프로브를 직장 에 배치하여 코어 온도를 모니터링합니다. 쥐를 마취한 후, 쥐를 척추 위치에 놓고 테이프로 4개의 팔다리를 테이블에 고정시하십시오. 세균성 비누로 복부를 면도하고 청소하십시오.2% 베타딘을 1~2분 이상 바르고 70%에탄올 용액으로 닦아냅니다. 이 시퀀스를 세 번 반복합니다. 멸균, 회향 드레이프로 수술 필드를 덮어.수직 복부 절개를 하고 왼쪽 신장, 요관, 복부 대어타 및 열등한 베나 카바를 노출시하십시오. 페디클을 자르기 직전에 조직을 해부합니다. PBS를 밀리리터 헤파린당 약 10단위로 혼합하여 쥐당 50밀리리터의 관류 용액을 준비합니다.PBS와 동일한 볼륨 8%PFA를 혼합하여 4%의 PFA 솔루션을 만듭니다. 수직 복부 절개를 미친 듯이 확장하여 손상을 피하기 위해 절단 할 때 가위를 장기에서 멀리 끌어 낼 수 있습니다. 흉곽을 통해 절개를 계속 한 다음 흉골을 들어 올려 다이어프램을 잘라냅니다.알리스 클램프로 피부의 느슨한 플랩을 철회하고, 집게로 결합 조직을 찢어 서 심장을 해방. PBS 라인을 열고 바늘을 왼쪽 심실에 넣기 전에 흐르는지 확인합니다. 무딘 집게로 심장을 부드럽게 잡고, 바늘을 제어하는 hemostat을 사용합니다.바늘은 분기 인치 이하를 삽입해야합니다. 바늘과 헤모스타트로 심장을 지탱하는 동안, 오른쪽 아트리움을 찾아, iridectomy 가위로 그것을 잘라. 쥐의 몸에 hemostat을 휴식, 바늘은 여전히 심장 내부에 위치 되어 있는지 확인.신장과 간에서 아직도 보이는 혈액이 있는 경우에 4 분 이상 PBS를 퍼플 계속합니다. 복부 대오르타와 열등한 베나 카바를 곁들인 왼쪽 신장을 수확하십시오. 요관, 흉부 대어타, 우수한 베나 카바 및 복부 대어타 가지를 리게이트하십시오.10센티미터 페트리 접시에 DPBS에 수화 된 장기를 유지합니다. 23 게이지 카테터와 복부 대자와 열등한 베나 카바를 수있습니다. 잔류 혈액을 제거하려면 캐뉼라를 연동 펌프와 연결하고 5 rpm및 섭씨 37도에서 90 분 동안 DPBS 500 밀리리터와 밀리리터 헤파린 당 16 단위로 장기를 씻으시게하십시오.신장을 탈세포화하기 위해 3 시간 동안 1 % Triton X-100으로 인퓨전한 다음 0.75 % SDS 용액을 수은 40 밀리리터의 일정한 압력으로 6 시간 동안 함유하십시오. 잔류 SDS를 제거하려면 18시간 동안 증류수에 1%페니실린을 사용한 다음 멸균 DPBS와 밀리리터 헤파린 당 16단위로 90분간 샘플을 인퓨즈합니다. 쥐 신장의 총 형태는 어두운 빨간색이었다.탈세포화 후 신장은 창백하고 반투명해졌습니다. 잔류 게놈 DNA는 탈세포 신장 비계에서 정량화되고 네이티브 신장에서 그와 비교하여 조직 게놈 DNA가 탈세포화 후에 거의 제거되었다는 것을 확인했습니다. 14건에서, 평균 DNA 함량은 대조군을 위한 마이크로리터당 115.05 나노그램, 탈세포화된 스캐폴드를 위한 마이크로리터당 1.96 나노그램이었다.총 98.3%의 DNA가 제거되었습니다. 3차원 구조는 유지되었고, 세포세포 사구는 피질 적당종에서 보존되었다. 왼쪽 심실에 바늘을 삽입 할 때, 그것은 분기 인치 이상 삽입해야합니다.추가 삽입은 다른 쪽으로 나올 수 있다. 우리는 이 기술이 조직 공학 분야에서 새로운 전망을 열 것이라는 확신을 가지고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

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