Name: preparation of decellularized kidney scaffolds in rats
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Denne studien ble støttet av et Biomedical Research Institute Grant fra Pusan National University Hospital.

Denne studien ble godkjent av administrasjonen av Pusan National University of Medicine og ble utført i samsvar med etiske retningslinjer for bruk og pleie av dyr. (sertifikat nr. 2017-119). Før noen dyrestudier bør institusjonell godkjenning oppnås. MERK: Alle kirurgiske instrumenter og bedøvelsesmidler/utstyr og reagenser som anbefales for vellykket kirurgisk presentasjon og avbildning av bukorganer er beskrevet i tabell 1.
1. Forberedelsesprosedyrer for høsting av ro...

<ol>
	<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression.">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li><li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering.">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li><li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering.">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li><li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+amniotic+membrane+(AM)+denuding+for+tissue+engineering.">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels.">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).</li><li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle;+implications+for+muscle+tissue+engineering.">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+definition+of+regenerative+medicine.">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li></ol>

Ulike protokoller har blitt brukt til decellularisering av organer og andre vev. Den optimale decellulariseringsprotokollen bør bevare den tredimensjonale arkitekturen til den ekstracellulære matrisen (ECM). Generelt består slike protokoller av å lyse cellemembranen ved fysisk behandling eller ioniske løsninger, dissosiere cytoplasma og kjerne fra ECM ved enzymatisk behandling eller vaskemidler, og deretter fjerne cellulært rusk fra vevet3. Fysiske prosesser inkluderer skraping, løsnings ag...

Cellekulturteknikker brukes til regenerering av funksjonell vev og organer for å erstatte syke eller skadede organer. Allogen organtransplantasjon er for tiden den vanligste behandlingen for irreversibel organskade; Denne tilnærmingen krever imidlertid bruk av immunsuppresjon for å forhindre avvisning av det transplanterte organet. Videre, til tross for fremskritt innen transplantasjonsimmunologi, kan 20% av transplantasjonsmottakerne oppleve akutt avvisning innen 5 år, og innen 10 år etter transplantasjon kan 40% av mottakerne miste sin transplanterte graft eller dø1.
Fremskritt innen vevsteknologier har gitt i et nytt paradigme for transplantasjon av nye organer uten immunavvisning ved hjelp av differensierte stamceller. Etter stamcelledifferensiering er det nødvendig med et stillas, kalt en syntetisk ekstracellulær matrise, for å lette genereringen av tredimensjonale organer og gjøre det nye vevet i stand til å trives i mottakeren. Stillaser fra decellulariserte innfødte organer har fordeler, inkludert et mer effektivt miljø for etablering av celler og forbedring av stamcelleproliferasjon, selv om disse mekanismene ikke er fullstendig belyst2. Spesielt er nyrene et passende organ for stillasgenerering fordi den har rikelig sirkulasjon og en nisje for stamcelleetablissement. I tillegg, på grunn av nyrens komplekse struktur, er det vanskelig å kunstig regenerere nyrer for organtransplantasjon.
I denne rapporten introduserer vi en metode for å utvikle vaskulære stillaser ved hjelp av decellulariserte organer i en rottemodell for å lette fremtidige dyrestudier for vevsteknikk.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 ethilon for vessel anastomosis</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>9032G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 PDS incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z316H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Prolene incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8832H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk spool vascular access/ligation in rat</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 PDS incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z773D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Prolene incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8831H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors to cut fascia/connective tissue</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>.023&#34; &#215; .038&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz microserrefine vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01 (straight)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18052-03 (curved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors to cut skin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of decellularized kidney scaffolds in rats

Vevsteknikk er en banebrytende disiplin innen biomedisin. Cellekulturteknikker kan brukes til regenerering av funksjonell vev og organer for å erstatte syke eller skadede organer. Stillas er nødvendig for å lette genereringen av tredimensjonale organer eller vev ved hjelp av differensierte stamceller in vivo. I denne rapporten beskriver vi en ny metode for å utvikle vaskulære stillaser ved hjelp av decellulariserte rotte nyrer. Åtte uker gamle Sprague-Dawley rotter ble brukt i denne studien, og heparin ble injisert i hjertet for å lette strømmen inn i nyrefartøyene, slik at heparin kunne parfyme inn i nyrefartøyene. Bukhulen ble åpnet, og venstre nyre ble samlet inn. De innsamlede nyrene ble perfundert i 9 timer ved hjelp av vaskemidler, som Triton X-100 og natriumdedylsulfat, for å decellularisere vevet. Decellulariserte nyre stillaser ble deretter forsiktig vasket med 1% penicillin / streptomycin og heparin for å fjerne cellulær rusk og kjemiske rester. Transplantasjon av stamceller med decellulariserte vaskulære stillasene forventes å lette genereringen av nye organer. Dermed kan de vaskulære stillasene gi grunnlag for vevsteknikk av organtransplantater i fremtiden.

Den grove morfologien til rotte nyrer var mørk rød (Figur 1A). Etter decellularisering ble nyrene ble bleke og gjennomskinnelige (Figur 1D). Resterende genomisk DNA ble vurdert med et kommersielt sett i henhold til produsentens instruksjoner, i decellulariserte nyrestillaser og sammenlignet med det i innfødte nyrer (kontroll). Kvantitativ analyse bekreftet at vevsgenomisk DNA nesten ble eliminert etter decellularisering. Fra 14 tilfeller var det gjennomsnittl...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Denne protokollen introduserer en metode for å utvikle et stillas ved hjelp av decellulariserte rotte nyrer. Protokollen inkluderer decellulariserings- og recellulariseringsprosesser for å bekrefte biotilgjengelighet. Decellularisering utføres ved hjelp av Triton X-100 og natrium dodecylsulfat.

Forberedelse av decellulariserte nyre stillaser hos rotter

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

Denne protokollen gjør det mulig å utvikle vaskulære stillaser ved hjelp av nyrer i en rottemodell. Nyrene er det mest egnede organet for stillaser av differensierte stamceller. Dette er en svært vellykket protokoll for decellularisering av nyrene.Det fjerner effektivt kjernene med minimal ødeleggelse av ECM ultrastruktur. Denne teknikken kan brukes på transplantasjonsmedisin og vevsteknikk. Kim Joo Hyoung, førsteamanuensis i plastisk kirurgi fra laboratoriet mitt, demonstrerer prosedyren.Til å begynne med, plasser den åtte uker gamle Sprague Dawley-rotten på en varmepute, og plasser en rektal termometerprobe i endetarmen for å overvåke kjernetemperaturen. Etter bedøvelse av rotten, plasser den i en liggende stilling, og fest de fire lemmer til bordet med tape. Barber og rengjør magen med bakteriedrepende såpe.Påfør 2%Betadine i minst ett til to minutter, og tørk det deretter av med en 70% etanolløsning. Gjenta denne sekvensen tre ganger. Dekk operasjonsfeltet med en steril, fenestert gardin.Lag et vertikalt abdominal snitt, og eksponer venstre nyre, urinleder, abdominal aorta og dårligere vena cava. Disseker vevet like før du kutter pedicle. Forbered 50 milliliter perfusjonsløsning per rotte ved å blande PBS med ca. 10 enheter per milliliter heparin.Bland like store volumer på 8 %PFA med PBS for å lage 4 %PFA-løsningen. Utvid det vertikale abdominal snittet kranialt, sørg for å trekke saksen bort fra organene når du kutter for å unngå skade. Fortsett snittet gjennom ribbeburet, og kutt deretter gjennom membranen ved å løfte brystbenet.Trekk den løse hudklaffen ut av veien med en Allis-klemme, og frigjør hjertet ved å rive eventuelt bindevev med tangene. Åpne PBS-linjen, og sørg for at den flyter før du plasserer kanylen i venstre ventrikel. Hold hjertet forsiktig med stumpe tang, og bruk en hemostat til å kontrollere nålen.Nålen skal settes inn ikke mer enn en kvart tomme. Mens du støtter hjertet med nålen og hemostat, finn riktig atrium, og klipp gjennom det med iridectomy saks. Hvil hemostaten på rottens kropp, og sørg for at nålen fortsatt er plassert inne i hjertet.Fortsett å parfyme PBS i fire minutter eller lenger hvis det fortsatt er blod synlig i nyre og lever. Høst venstre nyre med abdominal aorta og dårligere vena cava. Ligate urinlederen, thoracic aorta, overlegen vena cava, og grener av abdominal aorta.Hold orgelet hydrert i DPBS i en 10-centimeter Petri-tallerken. Kanylere abdominal aorta og dårligere vena cava med et 23-gauge kateter. For å fjerne gjenværende blod, koble kanylen med en peristaltisk pumpe, og vask orgelet med 500 milliliter DPBS og 16 enheter per milliliter heparin i 90 minutter ved fem rpm og 37 grader Celsius.For å decellularisere nyrene, parfyme det med 1% Triton X-100 i tre timer og deretter med 0,75% SDS-løsning i seks timer ved et konstant trykk på 40 milliliter kvikksølv. For å fjerne gjenværende SDS, perse prøven med 1% penicillin i destillert vann i 18 timer og deretter med sterile DPBS og 16 enheter per milliliter heparin i 90 minutter. Den grove morfologien til rotte nyrer var mørk rød.Etter decellularisering ble nyrene ble bleke og gjennomsiktige. Resterende genomisk DNA ble kvantifisert i decellulariserte nyrestillaser og sammenlignet med det i innfødte nyrer, og bekreftet at vevsgenomisk DNA nesten ble eliminert etter decellularisering. Fra 14 tilfeller var gjennomsnittlig DNA-innhold 115,05 nanogram per mikroliter for kontrollen og 1,96 nanogram per mikroliter for det decellulariserte stillaset.Totalt ble 98,3% av DNA fjernet. Den tredimensjonale strukturen ble opprettholdt, og acellulær glomeruli ble bevart i kortikale parenchyma. Når du setter nålen inn i venstre ventrikel, bør den settes inn ikke mer enn en kvart tomme.Ytterligere innsettinger kan komme ut på den andre siden. Vi har tillit til at denne teknikken vil åpne et nytt prospekt innen vevsteknikk.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopic tynntarm Transplantasjon i rotter

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Orthotopic Liver Transplantation in Rats

Orthotopic levertransplantasjon i Rats

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Vurdering av vaskulær funksjon hos pasienter med kronisk nyresykdom

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Murine Kidney Transplant Technique

Muse Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Nyre Perfusjons for Bevaring av Kidney grafts før Transplantasjon

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Histologisk Kvantifisering av kronisk hjerteinfarkt i rotter

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Vurdering av nyrefunksjon i musen modeller av Glomerular sykdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Blodplater-basert oppdagelsen av nitrogenoksid i blodet ved å måle VASP fosforylering

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

One-anastomosis Gastric Bypass (OAGB) in Rats

One-anastomosis Gastric Bypass OAGB in Rats

En-anastomose Gastric Bypass (OAGB) i rotter

The goal of this protocol is to set up a preclinical model of bariatric surgery and, more specifically, OAGB in obese rats. Based on this preclinical ...