Name: preparation of decellularized kidney scaffolds in rats
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантом Института биомедицинских исследований от больницы Пусанского национального университета.

Данное исследование было одобрено администрацией Пусанского национального медицинского университета и проводилось в соответствии с этическими рекомендациями по использованию и уходу за животными. (свидетельство No 2017-119). Перед любыми исследованиями на животных должно быть получено ?...

<ol>
	<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression.">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li><li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering.">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li><li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering.">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li><li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+amniotic+membrane+(AM)+denuding+for+tissue+engineering.">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels.">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).</li><li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle;+implications+for+muscle+tissue+engineering.">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+definition+of+regenerative+medicine.">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li></ol>

Для децеллюляризации органов и других тканей использовались различные протоколы. Оптимальный протокол децеллюляризации должен сохранять трехмерную архитектуру внеклеточного матрикса (ECM). В общем, такие протоколы состоят из лизирования клеточной мембраны путем физической обработки...

Методы культивирования клеток применяются для регенерации функциональных тканей и органов для замены больных или поврежденных органов. Аллогенная трансплантация органов в настоящее время является наиболее распространенным методом лечения необратимых повреждений органов; однако такой подход требует использования иммуносупрессии для предотвращения отторжения трансплантированного органа. Более того, несмотря на достижения в иммунологии трансплантата, 20% реципиентов трансплантата могут испытывать острое отторжение в течение 5 лет, а в течение 10 лет после трансплантации 40% реципиентов могут потерять свой пересаженный трансплантат или умереть1.
Достижения в технологиях тканевой инженерии привели к новой парадигме трансплантации новых органов без иммунного отторжения с использованием дифференцированных стволовых клеток. После дифференцировки стволовых клеток каркас, называемый синтетическим внеклеточным матриксом, необходим для облегчения генерации трехмерных органов и обеспечения процветания новой ткани в реципиенте. Каркасы из децеллюляризованных нативных органов имеют преимущества, в том числе более эффективную среду для созданияклеток и усиления пролиферации стволовых клеток, хотя эти механизмы не были полностью выяснены2. В частности, почка является подходящим органом для генерации каркасов, поскольку она имеет обильную циркуляцию и нишу для создания стволовых клеток. Кроме того, из-за сложной структуры почки трудно искусственно регенерировать почки для трансплантации органов.
В этом отчете мы представляем метод разработки васкуляризированных каркасов с использованием децеллюляризованных органов в модели крысы для облегчения будущих исследований на животных в целях тканевой инженерии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 ethilon for vessel anastomosis</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>9032G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 PDS incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z316H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Prolene incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8832H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk spool vascular access/ligation in rat</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 PDS incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z773D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Prolene incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8831H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors to cut fascia/connective tissue</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>.023&#34; &#215; .038&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz microserrefine vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01 (straight)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18052-03 (curved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors to cut skin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of decellularized kidney scaffolds in rats

Тканевая инженерия является передовой дисциплиной в биомедицине. Методы культивирования клеток могут применяться для регенерации функциональных тканей и органов для замены больных или поврежденных органов. Каркасы необходимы для облегчения генерации трехмерных органов или тканей с использованием дифференцированных стволовых клеток in vivo. В этом отчете мы описываем новый метод разработки васкуляризированных каркасов с использованием децеллюляризованных почек крыс. В этом исследовании использовались восьминедельные крысы Sprague-Dawley, и гепарин вводили в сердце, чтобы облегчить поступление в почечные сосуды, позволяя гепарину перфузировать в почечные сосуды. Брюшную полость открыли, а левую почку собрали. Собранные почки перфузили в течение 9 ч с использованием моющих средств, таких как Triton X-100 и додецилсульфат натрия, для децеллюляризации ткани. Затем децеллюляризованные каркасы почек осторожно промывали 1% пенициллином /стрептомицином и гепарином для удаления клеточного мусора и химических остатков. Ожидается, что трансплантация стволовых клеток с децеллюляризованными сосудистыми каркасами облегчит генерацию новых органов. Таким образом, васкуляризированные каркасы могут обеспечить основу для тканевой инженерии трансплантатов органов в будущем.

Грубая морфология почек крыс была темно-красной(рисунок 1А). После децеллюляризации почка стала бледной и полупрозрачной(рисунок 1D). Остаточную геномную ДНК оценивали с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя, в децеллю...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Этот протокол вводит метод разработки каркаса с использованием децеллюляризированных почек крыс. Протокол включает процессы децеллюляризации и рецеллюляризации для подтверждения биодоступности. Децеллюляризацию проводят с использованием Тритона Х-100 и додецилсульфата натрия.

Подготовка децеллюляризованных каркасов почек у крыс

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

Этот протокол позволяет разрабатывать васкуляризированные каркасы с использованием почек в модели крысы. Почка является наиболее подходящим органом для каркасов дифференцированных стволовых клеток. Это очень успешный протокол для децеллюляризации почки.Эффективно удаляет ядра с минимальным разрушением ультраструктуры ECM. Этот метод может быть применен к трансплантационной медицине и тканевой инженерии. Продемонстрировать процедуру будет Ким Джу Хён, адъюнкт-профессор пластической хирургии из моей лаборатории.Для начала поместите восьминедельную крысу Sprague Dawley на согревательную подушку и поместите ректальный термометр в прямую кишку, чтобы контролировать температуру ядра. После обезболивания крысу поместите ее в лежачем положении и закрепите четыре конечности к столу скотчем. Побрить и очистить живот бактерицидным мылом.Нанесите 2% бетадина в течение по крайней мере одной-двух минут, затем протрите его 70%-ным раствором этанола. Повторите эту последовательность три раза. Накройте операционное поле стерильной, фенестрированной драпировкой.Сделайте вертикальный разрез брюшной полости и обнажите левую почку, мочеточник, брюшную аорту и нижнюю полую вену. Рассекните ткань непосредственно перед разрезанием ножи. Приготовьте 50 миллилитров перфузионного раствора на крысу, смешивая PBS примерно с 10 единицами на миллилитр гепарина.Смешайте равные объемы 8% PFA с PBS, чтобы получить раствор 4% PFA. Вытяните вертикальный разрез брюшной полости кранизно, обязательно оттягивая ножницы от органов при разрезании, чтобы избежать повреждения. Продолжайте разрез через грудную клетку, а затем разрезайте диафрагму, подняв грудину.Убирайте рыхлый лоскут кожи с дороги с помощью зажима Allis и освободите сердце, разрывая любую соединительную ткань щипцами. Откройте линию PBS и убедитесь, что она течет, прежде чем помещать иглу в левый желудочек. Осторожно держите сердце тупыми щипцами и используйте гемостат для управления иглой.Иглу следует вводить не более чем на четверть дюйма. Поддерживая сердце иглой и гемостатом, найдите правое предсердие и прорежйте его ножницами иридэктомии. Положите гемостат на тело крысы и убедитесь, что игла все еще расположена внутри сердца.Продолжайте перфузию PBS в течение четырех минут или дольше, если в почках и печени все еще видна кровь. Собирают левую почку с брюшной аортой и нижней полой веной. Лигата мочеточника, грудной аорты, верхней полой вены и ветвей брюшной аорты.Держите орган гидратированным в DPBS в 10-сантиметровой чашке Петри. Канюлюляция брюшной аорты и нижней полой вены с помощью катетера 23-го калибра. Для удаления остаточной крови соедините канюлю с перистальтическим насосом, и промыть орган 500 миллилитрами DPBS и 16 единицами на миллилитр гепарина в течение 90 минут при пяти оборотах в минуту и 37 градусах Цельсия.Для децеллюляризации почки перфузируют ее 1% тритоном Х-100 в течение трех часов, а затем 0,75% раствором SDS в течение шести часов при постоянном давлении 40 миллилитров ртути. Чтобы удалить остаточный SDS, перфьмин 1% пенициллина в дистиллированной воде в течение 18 часов, а затем стерильным DPBS и 16 единицами на миллилитр гепарина в течение 90 минут. Грубая морфология почек крыс была темно-красной.После децеллюляризации почка стала бледной и полупрозрачной. Остаточная геномная ДНК была количественно определена в децеллюляризированных каркасах почек и сравнивалась с таковой в нативных почках, подтверждая, что геномная ДНК тканей была почти устранена после децеллюляризации. Из 14 случаев среднее содержание ДНК составляло 115,05 нанограмм на микролитр для контроля и 1,96 нанограмма на микролитр для децеллюляризированного каркаса.В общей сложности было удалено 98,3% ДНК. Трехмерная структура была сохранена, а в кортикальной паренхиме сохранились бесклеточные клубочки. При введении иглы в левый желудочек ее следует вводить не более чем на четверть дюйма.Любая дальнейшая вставка может выйти с другой стороны. Мы уверены, что данная методика откроет новую перспективу в области тканевой инженерии.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute Myocardial Infarction in Rats

Острого инфаркта миокарда у крыс

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Ортотопическая малого трансплантации кишечника у крыс

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Orthotopic Liver Transplantation in Rats

Ортотопической трансплантации печени у крыс

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Оценка функции сосудов у больных с хронической болезнью почек

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Murine Kidney Transplant Technique

Мышиные трансплантации почек Техника

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Нормотермических<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Почки перфузии по охране почки графты до трансплантации

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Гистологическое Количественное хронического инфаркте миокарда у крыс

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Оценка функции почек в моделях мыши клубочковых болезни

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Обнаружение на основе тромбоцитов оксида азота в крови путем измерения VASP фосфорилирование

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

One-anastomosis Gastric Bypass (OAGB) in Rats

One-anastomosis Gastric Bypass OAGB in Rats

Один анастомоза желудочного шунтирования (OAGB) у крыс

The goal of this protocol is to set up a preclinical model of bariatric surgery and, more specifically, OAGB in obese rats. Based on this preclinical ...