Name: preparation of decellularized kidney scaffolds in rats
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Denna studie stöddes av ett biomedicinskt forskningsinstituts anslag från Pusan National University Hospital.

Denna studie godkändes av administrering av Pusan National University of Medicine och genomfördes i enlighet med etiska riktlinjer för användning och vård av djur. (intyg nr 2017-119). Före djurstudier bör institutionellt godkännande erhållas. OBS: Alla kirurgiska och bedövningsmedel/utrustning och reagenser som rekommenderas för framgångsrik kirurgisk presentation och avbildning av bukorganen beskrivs i tabell 1.
1. Förberedelseförfaranden för skörd av råtta...

<ol>
	<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression.">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li><li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering.">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li><li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering.">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li><li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+amniotic+membrane+(AM)+denuding+for+tissue+engineering.">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels.">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).</li><li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle;+implications+for+muscle+tissue+engineering.">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+definition+of+regenerative+medicine.">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li></ol>

Olika protokoll har använts för avcellularisering av organ och andra vävnader. Det optimala avcelluleringsprotokollet bör bevara den tredimensionella arkitekturen hos den extracellulära matrisen (ECM). I allmänhet består sådana protokoll av att lysa cellmembranet genom fysisk bearbetning eller joniska lösningar, ta bort cytoplasman och kärnan från ECM genom enzymatisk bearbetning eller tvättmedel och sedan ta bort cellulärt skräp frånvävnaden 3. Fysiska processer inkluderar skrapni...

Cellkulturtekniker tillämpas för regenerering av funktionella vävnader och organ för att ersätta sjuka eller skadade organ. Allergiframkallande organtransplantation är för närvarande den vanligaste behandlingen för irreversibel organskada. Detta tillvägagångssätt kräver dock användning av immunsuppression för att förhindra avstötning av det transplanterade organet. Dessutom, trots framsteg inom transplantationsimmunologi, 20% av transplantation mottagare kan uppleva akut avstötning inom 5 år, och inom 10 år efter transplantation, 40% av mottagarna kan förlora sin transplanterade transplantat eller dö1.
Framsteg inom vävnadsteknik har gett vika i ett nytt paradigm för transplantation av nya organ utan immunavstötning med hjälp av differentierade stamceller. Efter stamcellsdiversitet behövs en byggnadsställning, kallad en syntetisk extracellulär matris, för att underlätta genereringen av tredimensionella organ och göra det möjligt för den nya vävnaden att trivas inom mottagaren. Byggnadsställningar från decellulära inhemska organ har fördelar, inklusive en effektivare miljö för etablering av celler och förbättring av stamcellsproliferation, även om dessa mekanismer inte har blivit helt klarlagda2. I synnerhet är njuren ett lämpligt organ för byggnadsställningsgenerering eftersom den har riklig cirkulation och en nisch för stamcellsinrättning. Dessutom, på grund av njurens komplexa struktur, är det svårt att artificiellt regenerera njurar för organtransplantation.
I denna rapport introducerar vi en metod för att utveckla vascularized byggnadsställningar med hjälp av decellulariserade organ i en råtta modell för att underlätta framtida djurstudier för vävnadstekniska ändamål.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 ethilon for vessel anastomosis</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>9032G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 PDS incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z316H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Prolene incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8832H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk spool vascular access/ligation in rat</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 PDS incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z773D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Prolene incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8831H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors to cut fascia/connective tissue</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>.023&#34; &#215; .038&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz microserrefine vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01 (straight)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18052-03 (curved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors to cut skin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of decellularized kidney scaffolds in rats

Vävnadsteknik är en spjutspetsdisciplin inom biomedicin. Cellkulturtekniker kan tillämpas för regenerering av funktionella vävnader och organ för att ersätta sjuka eller skadade organ. Byggnadsställningar behövs för att underlätta genereringen av tredimensionella organ eller vävnader med hjälp av differentierade stamceller in vivo. I denna rapport beskriver vi en ny metod för att utveckla vascularized byggnadsställningar med hjälp av decellularized råtta njurar. Åtta veckor gamla Sprague-Dawley råttor användes i denna studie, och heparin injicerades i hjärtat för att underlätta flödet i njurkärlen, så att heparin kan läsa in i njurkärlen. Bukhålan öppnades, och den vänstra njuren samlades in. De insamlade njurarna perfused för 9 h med hjälp av tvättmedel, såsom Triton X-100 och natrium dodecyl sulfat, att avcellularisera vävnaden. Decellulariserade njurställningar tvättades sedan försiktigt med 1% penicillin/streptomycin och heparin för att ta bort cellulära skräp och kemiska rester. Transplantation av stamceller med decellulerade kärlställningar förväntas underlätta genereringen av nya organ. Således kan de vascularized byggnadsställningarna ge en grund för vävnadsteknik av organtransplantat i framtiden.

Rått njurarnas grova morfologi var mörkröd (Figur 1A). Efter decellulariseringen blev njuren blek och genomskinlig (Figur 1D). Restgenomiskt DNA bedömdes med ett kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner, i decellulära njurställningar och jämfört med det i inhemska njurar (kontroll). Kvantitativ analys bekräftade att vävnad genomisk DNA nästan eliminerades efter decellularisering. Från 14 fall var det genomsnittliga DNA-innehållet 115,05 n...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Detta protokoll introducerar en metod för att utveckla en byggnadsställning med hjälp av decellulära råtta njurar. Protokollet omfattar avcellulerings- och omcelluleringsprocesser för att bekräfta biotillgängligheten. Avcellularisering utförs med triton X-100 och natrium dodecylsulfat.

Beredning av decellulära njurställningar hos råttor

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

Detta protokoll gör det möjligt att utveckla vascularized byggnadsställningar med njurar i en råtta modell. Njuren är det mest lämpliga organet för byggnadsställningar av differentierade stamceller. Detta är ett mycket framgångsrikt protokoll för avcellularisering av njuren.Det tar effektivt bort kärnorna med minimal förstörelse av ECM ultrastruktur. Denna teknik kan tillämpas på transplantation medicin och vävnadsteknik. Kim Joo Hyoung, docent i plastikkirurgi från mitt laboratorium, visar att ingreppet kommer att visa att det blir Kim Joo Hyoung, docent i plastikkirurgi.Till att börja med placera den åtta veckor gamla Sprague Dawley-råttan på en värmande dyna och placera en rektal termometersond i ändtarmen för att övervaka kärntemperaturen. Efter att ha sövt råttan, placera den i ett supinläge och säkra de fyra extremiteterna till bordet med tejp. Raka och rengör buken med bakteriedär tvål.Applicera 2%Betadin i minst en till två minuter och torka sedan av det med en 70%etanollösning. Upprepa den här sekvensen tre gånger. Täck det operativa fältet med ett sterilt, fenestrerat draperi.Gör ett vertikalt buksnitt och exponera vänster njure, urinrör, bukaorta och sämre vena cava. Dissekera vävnaden precis innan du skär pedikeln. Bered 50 milliliter perfusionslösning per råtta genom att blanda PBS med cirka 10 enheter per milliliter heparin.Blanda lika stora volymer på 8 %PFA med PBS för att skapa 4%PFA-lösningen. Förläng det vertikala buksnittet kranialt och se till att dra saxen bort från organen när du skär för att undvika skador. Fortsätt snittet genom revbenskorgen och skär sedan genom membranet genom att lyfta bröstbenet.Dra tillbaka den lösa hudluckan ur vägen med en Allis-klämma och befria hjärtat genom att riva eventuell bindväv med tången. Öppna PBS-linjen och se till att den flyter innan nålen placeras i den vänstra ventrikeln. Håll hjärtat försiktigt med trubbiga tång och använd en hemostat för att kontrollera nålen.Nålen ska inte sättas in mer än en kvarts tum. Medan du stöder hjärtat med nålen och hemostaten, hitta rätt atrium och snip genom det med iridectomy sax. Vila hemostaten på råttans kropp och se till att nålen fortfarande är placerad inuti hjärtat.Fortsätt att genomsyra PBS i fyra minuter eller längre om det fortfarande finns blod synligt i njuren och levern. Skörda den vänstra njuren med bukaortan och sämre vena cava. Ligate urinrör, bröst aorta, överlägsen vena cava och grenar av buken stora kroppspulsådern.Förvara organet hydratiserat i DPBS i en 10 centimeters petriskål. Kannulera buken aorta och sämre vena cava med en 23-gauge kateter. För att avlägsna kvarvarande blod, anslut kanylen med en peristaltisk pump och tvätta organet med 500 milliliter DPBS och 16 enheter per milliliter heparin i 90 minuter vid fem varv/min och 37 grader Celsius.För att avcellulera njuren, granska den med 1%Triton X-100 i tre timmar och sedan med 0,75% SDS-lösning i sex timmar vid ett konstant tryck på 40 milliliter kvicksilver. För att avlägsna kvarvarande SDS, granska provet med 1% penicillin i destillerat vatten i 18 timmar och sedan med sterila DPBS och 16 enheter per milliliter heparin i 90 minuter. Den grova morfologin hos råtta njurar var mörkröd.Efter decellularisering blev njuren blek och genomskinlig. Restgenomiskt DNA kvantifierades i decellulära njurställningar och jämfördes med det i inhemska njurar, bekräftar att vävnad genomisk DNA nästan eliminerades efter decellularisering. Från 14 fall var det genomsnittliga DNA-innehållet 115,05 nanogram per mikroliter för kontrollen och 1,96 nanogram per mikroliter för den decellulära ställningen.Totalt togs 98,3% av DNA bort. Den tredimensionella strukturen bibehölls och acellulära glomeruli bevarades i när parenkym. När nålen sätts in i vänster kammare ska den inte sättas in mer än en kvarts tum.Ytterligare införande kan komma ut på andra sidan. Vi är förtronade till att denna teknik kommer att öppna en ny möjlighet inom vävnadsteknik.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute Myocardial Infarction in Rats

Akut hjärtinfarkt hos råttor

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopic tunntarmstransplantation i råttor

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Orthotopic Liver Transplantation in Rats

Ortotopisk Levertransplantation hos råttor

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Bedömning av kärlfunktionen hos patienter med kronisk njursjukdom

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Murine Kidney Transplant Technique

Murin njurtransplantation Teknik

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex vivo</em&gt; Njure Perfusion för bevarandet av Njure transplantat före transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Histologisk Kvantifiering av kronisk hjärtinfarkt hos råttor

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Bedömning av njurfunktion i musmodeller av glomerulär sjukdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Trombocyt-baserad detektion av kväveoxid i blodet genom att mäta VASP fosforylering

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

One-anastomosis Gastric Bypass (OAGB) in Rats

One-anastomosis Gastric Bypass OAGB in Rats

En-anastomos Gastric Bypass (OAGB) hos råttor

The goal of this protocol is to set up a preclinical model of bariatric surgery and, more specifically, OAGB in obese rats. Based on this preclinical ...