Name: preparation of decellularized kidney scaffolds in rats
Uploaded: 2021-03-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Bu çalışma Pusan Ulusal Üniversite Hastanesi'nden Biyomedikal Araştırma Enstitüsü Hibesi ile desteklendi.

Bu çalışma Pusan Ulusal Tıp Üniversitesi yönetimi tarafından onaylanmış ve hayvanların kullanımı ve bakımı için etik kurallara uygun olarak yapılmıştır. (sertifika no. 2017-119). Herhangi bir hayvan çalışması öncesinde kurumsal onay alınmalıdır. NOT: Karın organlarının başarılı cerrahi sunumu ve görüntülenmesi için önerilen tüm cerrahi ve anestezik aletler/ekipmanlar ve reaktifler Tablo 1'deayrıntılı olarak açıklanmıştır.
1. Sı?...

<ol>
	<li>Kawai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+HLA-mismatched+renal+transplantation+without+maintenance+immunosuppression.">Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression.</a> New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).</li><li>Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+scaffolds+for+stem+cell-driven+tissue+engineering.">Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).</li><li>Fu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+technologies+in+tissue+engineering.">Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering.</a> Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).</li><li>Hopkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+amniotic+membrane+(AM)+denuding+for+tissue+engineering.">Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+decellularization+methods+on+extracellular+matrix+derived+hydrogels.">The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).</li><li>Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+decellularization+process+of+an+upper+limb+skeletal+muscle;+implications+for+muscle+tissue+engineering.">Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering.</a> Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Mason, C., Dunnill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+definition+of+regenerative+medicine.">A brief definition of regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).</li></ol>

Organların ve diğer dokuların hücreden arındırılması için çeşitli protokoller kullanılmıştır. En uygun hücre dışılaştırma protokolü, hücre dışı matrisin (ECM) üç boyutlu mimarisini korumalıdır. Genel olarak, bu tür protokoller hücre zarının fiziksel işleme veya iyonik çözeltilerle lizin edilmesi, sitoplazma ve çekirdeğin enzimatik işleme veya deterjanlarla ECM'den ayrıştırması ve daha sonra hücresel kalıntıların dokudan çıkarılmasından oluşur3. ...

Hücre kültürü teknikleri, hastalıklı veya hasarlı organların yerini alacak fonksiyonel doku ve organların yenilenmesi için uygulanır. Allojenik organ nakli şu anda geri dönüşü olmayan organ hasarının en yaygın tedavisidir; ancak bu yaklaşım, nakledilen organın reddedilmesini önlemek için immünosupresyon kullanılmasını gerektirir. Ayrıca, transplant immünolojislerindeki gelişmelere rağmen, nakil alıcılarının% 20'si 5 yıl içinde akut ret yaşayabilir ve transplantasyondan sonraki 10 yıl içinde, alıcıların% 40'ı nakledilen greftini kaybedebilir veya1ölebilir.
Doku mühendisliği teknolojilerindeki gelişmeler, farklılaştırılmış kök hücreler kullanılarak bağışıklık reddi olmadan yeni organların nakli için yeni bir paradigma ortaya koymuştur. Kök hücre farklılaşmasından sonra, üç boyutlu organların üretilmesini kolaylaştırmak ve yeni dokunun alıcı içinde gelişmesini sağlamak için sentetik hücre dışı matris adı verilen bir iskeleye ihtiyaç vardır. Hücre dışılaştırılmış yerli organlardan gelen iskeleler, hücrelerin kurulması ve kök hücre çoğalmasının artırılması için daha etkili bir ortam da dahil olmak üzere avantajlara sahiptir, ancak bu mekanizmalar tam olarak aydınlatılmamıştır2. Özellikle böbrek, bol dolaşıma ve kök hücre kuruluşu için bir nişe sahip olduğu için iskele üretimi için uygun bir organdır. Ek olarak, böbreğin karmaşık yapısı nedeniyle, organ nakli için böbrekleri yapay olarak yenilemek zordur.
Bu raporda, doku mühendisliği amacıyla gelecekteki hayvan çalışmalarını kolaylaştırmak için bir sıçan modelinde hücreden sönmemiş organlar kullanarak damarlı iskeleler geliştirme yöntemini tanıtıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-0 ethilon for vessel anastomosis</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>9032G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 PDS incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z316H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Prolene incision closure rat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8832H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk spool vascular access/ligation in rat</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 PDS incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z773D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Prolene incision closure mouse</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8831H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SUT-S 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors to cut fascia/connective tissue</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>.023&#34; &#215; .038&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz microserrefine vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01 (straight)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18052-03 (curved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors to cut skin</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of decellularized kidney scaffolds in rats

Doku mühendisliği biyotıpta son teknoloji bir disiplindir. Hastalıklı veya hasarlı organların yerine fonksiyonel doku ve organların yenilenmesi için hücre kültürü teknikleri uygulanabilir. Vivo olarak farklılaştırılmış kök hücreler kullanılarak üç boyutlu organ veya dokuların üretilmesini kolaylaştırmak için iskelelere ihtiyaç vardır. Bu raporda, hücreden sönmemiş sıçan böbrekleri kullanarak damarlı iskeleler geliştirmek için yeni bir yöntem anlatıyoruz. Bu çalışmada sekiz haftalık Sprague-Dawley sıçanları kullanıldı ve heparin böbrek damarlarına akışı kolaylaştırmak için kalbe enjekte edildi ve heparinin böbrek damarlarına nüfuz etmesini sağladı. Karın boşluğu açıldı ve sol böbrek toplandı. Toplanan böbrekler, dokuyu hücreden çıkarmak için Triton X-100 ve sodyum dodecyl sülfat gibi deterjanlar kullanılarak 9 saat boyunca perfüzyona uğradı. Hücreden çıkarıcı böbrek iskeleleri daha sonra hücresel kalıntıları ve kimyasal kalıntıları gidermek için% 1 penisilin / streptomisinin ve heparin ile nazikçe yıkandı. Kök hücrelerin hücre dışılaştırılmış damar iskeleleri ile naklinin yeni organların üretilmesini kolaylaştırması beklanmaktadır. Böylece, damarlı iskeleler gelecekte organ greftlerinin doku mühendisliği için bir temel sağlayabilir.

Sıçan böbreklerinin brüt morfolojisi koyu kırmızıydı (Şekil 1A). Hücreden arındırma sonrası böbrek soluk ve yarı saydam hale geldi(Şekil 1D). Kalıntı genomik DNA, üreticinin talimatlarına göre, hücreden sönmemiş böbrek iskelelerinde ve yerli böbreklerdeki (kontrol) ile karşılaştırıldığında ticari bir kit ile değerlendirildi. Kantitatif analiz, doku genomik DNA'sının hücreden arındırıldıktan sonra neredeyse ortadan kaldı...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats at JoVE.com

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Bu protokol, hücreden sönmemiş sıçan böbrekleri kullanarak bir iskele geliştirmek için bir yöntem sunar. Protokol, biyoyararlanıcılığı doğrulamak için hücreden arındırma ve yeniden hücreleştirme süreçlerini içerir. Desellülerizasyon Triton X-100 ve sodyum dodecyl sülfat kullanılarak gerçekleştirilir.

Sıçanlarda Hücreden Sönmemiş Böbrek İskelelerinin Hazırlanması

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

Bu protokol, bir sıçan modelinde böbrekler kullanılarak damarlı iskelelerin geliştirilmesini mümkün kılar. Böbrek, farklılaşmış kök hücrelerin iskeleleri için en uygun organdır. Bu, böbreğin hücreden arındırılması için oldukça başarılı bir protokoldür.ECM ultrayapısının minimum tahribatı ile çekirdekleri etkili bir şekilde temizler. Bu teknik transplantasyon tıbbı ve doku mühendisliğine uygulanabilir. Prosedürü gösteren kim Joo Hyoung, laboratuvarımdan plastik cerrahi yüksek lisans/doktora doçenti.Başlamak için, sekiz haftalık Sprague Dawley sıçanını bir ısınma yastığına yerleştirin ve çekirdek sıcaklığını izlemek için rektumda bir rektal termometre probu yerleştirin. Sıçanı uyuşturuyorktan sonra, bir supine pozisyonuna getirin ve dört uzvu bantla masaya sabitleyin. Karnı mikrop öldürücü sabunla tıraş edin ve temizleyin.%2 Betadin'i en az bir ila iki dakika uygulayın, ardından% 70 etanol çözeltisi ile silin. Bu sırayı üç kez tekrarlayın. Ameliyat alanını steril, fenestratlı bir örtü ile örtün.Dikey bir karın kesiği yapın ve sol böbreği, üretteri, abdominal aortu ve alt vena kavayı ortaya çıkarın. Pedileyi kesmeden hemen önce dokuyu parçalara ayrıştırın. PBS'yi mililitre heparin başına yaklaşık 10 ünite ile karıştırarak sıçan başına 50 mililitre perfüzyon çözeltisi hazırlayın.%4 PFA çözümünü yapmak için PBS ile %8 PFA eşit hacimleri karıştırın. Dikey karın kesisini krank olarak uzatın, hasar görmemesi için keserken makası organlardan uzaklaştırdığınızdan emin olun. Kesiği göğüs kafesinden devam ettirin ve ardından sternumu kaldırarak diyaframı kesin.Bir Allis kelepçesi ile gevşek deri kapağını geri çekin ve herhangi bir bağ dokusunups ile yırtarak kalbi serbest bırakın. PBS hattını açın ve iğneyi sol ventriküle yerleştirmeden önce aktığından emin olun. Kalbi künt tokmaklarla hafifçe tutun ve iğneyi kontrol etmek için bir hemostat kullanın.İğne en fazla çeyrek inç sokulmalıdır. İğne ve hemostat ile kalbi desteklerken, sağ kulakçığı bulun ve iridektomi makası ile içinden kesin. Hemostat farenin vücuduna yaslanın ve iğnenin hala kalbin içine yerleştirilmiş olduğundan emin olun.Böbrek ve karaciğerde hala kan görünüyorsa, PBS'ye dört dakika veya daha uzun süre perfüzyona devam edin. Sol böbreği abdominal aort ve inferior vena kava ile hasat edin. Üretter, torasik aort, üstün vena kava ve abdominal aortu dallarını ligat.Organı 10 santimetrelik petri kabında DPBS'de nemlendirin. Abdominal aort ve inferior vena kavayı 23-gauge kateter ile yalıtın. Artık kanı çıkarmak için, kanülleri peristaltik bir pompaya bağlayın ve organı 500 mililitre DPBS ve mililitre heparin başına 16 ünite ile beş rpm ve 37 santigrat derecede 90 dakika yıkayın.Böbreği hücreden çıkarmak için, üç saat boyunca% 1 Triton X-100 ve ardından 40 mililitre cıva sabit basıncında altı saat boyunca% 0.75 SDS çözeltisi ile perfuse edin. Artık SDS'yi çıkarmak için, numuneyi damıtılmış suda%1 penisilin ile 18 saat ve daha sonra steril DPBS ve mililitre heparin başına 16 ünite ile 90 dakika boyunca perfuse edin. Sıçan böbreklerinin brüt morfolojisi koyu kırmızıydı.Hücreden arındırma sonrasında böbrek soluk ve yarı saydam hale geldi. Artık genomik DNA hücre dışı böbrek iskelelerinde ölçüldü ve yerli böbreklerdekiyle karşılaştırıldığında, doku genomik DNA'sının hücreden arındırıldıktan sonra neredeyse ortadan kaldırıldığını doğruladı. 14 vakadan ortalama DNA içeriği kontrol için mikroliter başına 115,05 nanogram, hücreden çıkarılanmış iskele için mikroliter başına 1,96 nanogramdı.Toplamda DNA'nın %98,3'ü çıkarıldı. Kortikal parenkimde üç boyutlu yapı korunmuş ve asellüler glomeruli korunmuştur. İğneyi sol ventrikül içine yerleştirirken, çeyrek inçten fazla yerleştirilmemelidir.Başka bir ekleme diğer taraftan çıkabilir. Bu tekniğin doku mühendisliği alanında yeni bir umut açacağına olan güvenimiz tamdır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute Myocardial Infarction in Rats

Sıçanlarda Akut Miyokard Enfarktüsü

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Sıçanlarda Ortotopik Küçük Bağırsak Nakli

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Orthotopic Liver Transplantation in Rats

Sıçanlarda Ortotopik Karaciğer Nakli

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Kronik Böbrek Hastalarında Vasküler Fonksiyon Değerlendirilmesi

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Murine Kidney Transplant Technique

Murin Böbrek nakli Tekniği

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Böbrek Koruma Böbrek Nakli Perfüzyon önce greftler

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Sıçanlar Kronik Kalp Enfarktüsü histolojik Niceleme

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

One-anastomosis Gastric Bypass (OAGB) in Rats

One-anastomosis Gastric Bypass OAGB in Rats

Sıçanlarda bir anastomoz Gastrik Bypass (OAGB)

The goal of this protocol is to set up a preclinical model of bariatric surgery and, more specifically, OAGB in obese rats. Based on this preclinical ...