Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) og Medical Research Foundation fra Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).

BEMÆRK: Dette er en ikke-overlevelsesoperation. Alle procedurer, der involverer brug af dyr, blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Oregon Health & Science University (IACUC godkendelsesnummer: TR01_IP00000968).
1. Fremstilling af fluorescerende mærkede blodlegemer
<ol><li>Anæstetisere donormusene (C57BL/6J-hanmus i alderen ~6 uger) med en intraperitoneal (i.p.) injektion af ketamin/xylazinbedøvelsesopløsning (5 ml/kg, se materialetabelle...

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+[corrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research.">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li><li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention.">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li><li>Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow.">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li><li>Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders.">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).</li><li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants.">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li><li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser+Doppler:+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow.">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li><li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI.">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li><li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system.">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).</li><li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow.">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li><li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo.">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li><li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

Dette papir demonstrerer, hvordan kapillærer i den cochleære sidevæg (og i stria vascularis) i en musemodel kan visualiseres med fluorophormærkning i et åbent karvinduespræparat under et FIVM-system. Musemodel er meget udbredt og foretrukket som en pattedyrsmodel til undersøgelse af menneskers sundhed og sygdom. Protokollen beskrevet her er en gennemførlig tilgang til billeddannelse og undersøgelse af CoBF i musens laterale væg (især i stria vascularis) ved hjælp af et åbent karvindue under FIVM-systemet Met...

Normal funktion af mikrocirkulationen i den laterale cochlearvæg (der omfatter størstedelen af kapillærerne i spiralbåndet og stria vascularis) er kritisk vigtig for at opretholde hørefunktionen1. Unormal CoBF er impliceret i patofysiologien af mange indre ørelidelser, herunder støjinduceret høretab, ørehydrops og presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisering af intravital CoBF vil muliggøre en bedre forståelse af sammenhængen mellem hørefunktion og cochlear vaskulær patologi.
Selvom kompleksiteten og placeringen af cochlea i den tidsmæssige knogle udelukker direkte visualisering og måling af CoBF, er der udviklet forskellige metoder til vurdering af CoBF, herunder laser-doppler flowmetri (LDF)10,11,12, magnetisk resonansbilleddannelse (MRI)13, fluorescens intravital mikroskopi (FIVM)14, fluorescensmikroendoskopi (FME)15, endoskopisk laserplet kontrastbilleddannelse (LSCI)16 og tilgange baseret på injektion af mærkede markører og radioaktivt mærkede mikrosfærer i blodbanen (optisk mikroangiografi, OMAG)17,18,19,20. Ingen af disse metoder har dog muliggjort absolut realtidssporing af ændringer i CoBF in vivo, med undtagelse af FIVM. FIVM, i kombination med et karvindue i den laterale cochlearvæg, er en tilgang, der er blevet brugt og valideret i marsvin under forskellige forsøgsbetingelser af forskellige laboratorier 14,21,22.
En FIVM-metode blev med succes etableret til at studere de strukturelle og funktionelle ændringer i cochlearmikrocirkulationen i mus ved hjælp af fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran som kontrastmedium og fluorescensfarvestof - enten DiO (3, 3′-dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat, grøn) eller Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyaninperchlorat, rød)-til formærkning af blodlegemer, visualisering af kar og sporing af blodgennemstrømningshastighed. I denne undersøgelse er protokollen for denne metode blevet beskrevet til billeddannelse og kvantificering af ændringer i CoBF hos mus under normale og patologiske forhold (såsom efter støjeksponering). Denne teknik giver forskeren de nødvendige værktøjer til at undersøge de underliggende mekanismer i CoBF relateret til høredysfunktion og patologi i stria vascularis, især når de anvendes sammen med let tilgængelige transgene musemodeller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

Transduktion af lyd er metabolisk krævende, og den normale funktion af mikrovaskulaturen i sidevæggen er afgørende for at opretholde endodocochlearpotentiale, iontransport og væskebalance. Forskellige former for hørelidelser rapporteres at involvere unormal mikrocirkulation i cochlea. Undersøgelse af, hvordan cochlear blodgennemstrømning (CoBF) patologi påvirker hørefunktionen, er udfordrende på grund af manglen på gennemførlige forhørsmetoder og vanskeligheden ved at få adgang til det indre øre. Et åbent karvindue i den laterale cochlearvæg kombineret med fluorescens intravital mikroskopi er blevet brugt til at studere CoBF-ændringer in vivo, men mest hos marsvin og først for nylig i musen. Dette papir og den tilhørende video beskriver den åbne kar-vinduesmetode til visualisering af blodgennemstrømningen i musens cochlea. Detaljer omfatter 1) forberedelse af den fluorescerende mærkede blodcellesuspension fra mus; 2) konstruktion af et åbent karvindue til intravital mikroskopi i en bedøvet mus, og 3) måling af blodgennemstrømningshastighed og volumen ved hjælp af en offline optagelse af billeddannelsen. Metoden præsenteres i videoformat for at vise, hvordan man bruger open window-tilgangen i mus til at undersøge strukturelle og funktionelle ændringer i cochlear-mikrocirkulationen under normale og patologiske forhold.

Efter kirurgisk eksponering af cochlearkapillærerne i sidevæggen (figur 1) var intravital højopløsningsmikroskopisk observation af Dil-mærkede blodlegemer i FITC-dextran-mærkede kar mulig gennem et åbent karvindue. Figur 2A er et repræsentativt billede taget under FIVM, der viser kapillærerne i musens cochlear apex-middle turn lateral wall. Luminaen af disse fartøjer synliggøres ved fluorescensen af FITC-dextran blande...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

En åben kar-vinduestilgang ved hjælp af fluorescerende sporstoffer giver tilstrækkelig opløsning til cochlear blodgennemstrømning (CoBF) måling. Metoden letter undersøgelsen af strukturelle og funktionelle ændringer i CoBF hos mus under normale og patologiske forhold.

Måling af strial blodgennemstrømning i musecochlea ved hjælp af et åbent karvindue og intravital fluorescensmikroskopi

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Normal blodforsyning til cochlea er kritisk vigtig for cochlea Menières sygdom, især for at opretholde indendørs cochlearpotentiale, som er den væsentlige drivkraft for hårcelletransaktion. Denne funktion af blodcirkulationen har været tæt forbundet med forskellige former for høretab. Bedre forståelse af cochlear blodgennemstrømning vil muliggøre en mere effektiv håndtering af høreforstyrrelser som følge af dysfunktion i blodgennemstrømningen.Imidlertid er direkte blodgennemstrømningsmåling meget meget udfordrende på grund af vanskeligheder med at vurdere det indre øre. Teknikker til vurdering af cochlear blodgennemstrømning er i øjeblikket stadig under udvikling. Her demonstrerer vi en af de seneste metoder, der er etableret i vores laboratorium åbne muskelvindue i indkvartering med høj opløsning fluorescensmikroskop for at indsnævre cochlear blodgennemstrømning i små dyrearter som mus.Anvendelse af denne teknik med transgenetiske massemodeller har potentialet til at fremme forskning for at opklare forbindelserne mellem hørefunktion og patologien relateret til cochlear blodgennemstrømning i intravaskulær risiko. Vores procedurer bør udføres med forsigtighed. Ud over øjeblikkelig kropsblødning skal dyrets vitale tegn, herunder blodtryk og hjerteslag, overvåges under din operation.Begynd med at samle cirka en millimeter blod i heparin ved hjertepunktur. Centrifuge blodet ved 3000 gange G i tre minutter ved fire grader Celsius. Fjern plasmaet, vask derefter blodcellepelleten med en milliliter PBS tre gange ved centrifugering ved 3000 gange G i tre minutter ved fire grader Celsius.Mærk blodcellerne med en milliliter 20 mikromolær DiO eller Dil i PBS, og inkuber i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur. Vask de mærkede blodlegemer med en milliliter PBS og centrifuge tre gange ved 3000 gange G i tre minutter. Resuspender cellepellet i 30% hæmatokrit med ca. 0,9 ml PBS før injektion.Forbered sterile kirurgiske instrumenter og billeddannelsesplatform, og læg en varmepude under draperingen. Overvåg den dårlige refleks og generelle muskeltonus hos de bedøvede mus for at kontrollere dybden af anæstesi. Placer dyret på den varme varmepude og halen i monitorsystemet til overvågning af blodtryk og hjerteslag.Oprethold den rektale temperatur ved 37 grader Celsius og registrer dyrets systoliske blodtryk, diastoliske blodtryk og gennemsnitlige blodtryk i bedøvet tilstand. Åbn den venstre tympaniske bulla via en lateral og vental tilgang under et stereomikroskop, der efterlader trommehinden og knoglerne intakte. Lav et snit langs midterlinjen af dyrets hals med hovedet immobiliseret for at minimere bevægelsen.Fjern den venstre sub mandibulære kirtel og bageste mave af den digastriske muskel og cauterize. Find og udsæt den benede bulla ved at identificere sternocleidomastoid muskel og ansigtsnerve, der strækker sig anterior mod bulla. Åbn den benede bulla med en 30 gauge nål og fjern forsigtigt den omgivende knogle med kirurgisk pincet for at give et klart overblik over cochlear og stapedial arterie med sin mediale margin liggende over kanten af den runde vinduesniche og forårsager forreste overlegen mod det ovale vindue.Brug et lille knivblad til at skrabe sidevægsknoglen ved toppen af musens cochlea ca. 1,25 millimeter fra toppen, indtil en tynd plet er revnet. Fjern knoglespånerne med små trådkroge. Dæk karvinduet med en afskåret dæksel for at bevare normale fysiologiske forhold og give et optisk billede til optagelse af fartøjsbilleder.Lav et snit på en centimeter langs den højre saphenøse vene for at udsætte fartøjet. Tilsæt successivt 100 mikroliter hver af FITC-Dextran-opløsningen og blodcellesuspensionen i dyret gennem den saphenøse vene for at muliggøre visualisering af blodkarrene og sporing af blodgennemstrømningen. Overhold blodgennemstrømningen i realtid på en videomonitor fem minutter efter injektionen.Forestil dig blodkarrene ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med et langdistancemål og et lampehus, der indeholder et excitationsfilter med flere bånd og kompatibelt emissionsfilter. Optag videoen ved hjælp af et digitalt sort-hvidt opladningskoblet enhedskamera med høj opløsning, der erhverver mere end 350 billeder pr. Video. For at sikre en vellykket analyse af strømningshastigheden.Mål beholderdiameteren ved hjælp af passende software, og bestem afstanden mellem to faste punkter på tværs af fartøjet i de erhvervede billeder. Åbn videoen af blodgennemstrømningen i softwaren, og indstil skalaen på billederne. Spor de valgte DiO-farvede blodlegemer ved hjælp af sporingsfunktionen.Brug derefter den afstand, cellerne har bevæget, og tidsintervallet mellem billedrammerne i videoen til automatisk beregning af strømningshastigheden. Beregn den volumetriske strøm ved hjælp af ligningen i tekstmanuskriptet. For at skabe støjeksponeringsmodellen før optagelse af blodgennemstrømningen skal du placere dyrene i trådnetbure og udsætte dem for bredbåndsstøj ved 120 decibel lydtrykniveau i en lydeksponeringsboks i tre timer.Derefter i yderligere tre timer den næste dag. Optag blodgennemstrømningen to uger efter støjeksponering. Efter kirurgisk eksponering af cochlearkapillærerne i sidevæggen blev intravital højopløsningsmikroskopisk observation af DiL-mærkede blodlegemer i FITC Dextran-mærkede kar udført gennem et åbent karvindue.DiL-mærkede blodlegemer i Stria-kar mærket med FITC Dextran er vist her. Dio-mærkede blodlegemer mærket med FITC Dextran viser, at kartætheden af spiralbåndet er sparsommere end den tættere Stria vascularis. IVM i høj opløsning viser blodgennemstrømningsmønstrene i kontrol- og støjudsatte grupper.Det forstyrrede mønster af blodcirkulation kan ses i de støjudsatte grupper. Anomalier omfattede reduceret beholderdiameter og øget variation i beholderdiameter. Blodgennemstrømningshastighederne i kontrol- og støjeksponeringsgrupperne blev beregnet ved at spore rødderne af de DiO-mærkede blodlegemer.Blodhastigheden og volumen i den støjeksponerede gruppe var signifikant lavere end i kontrolgruppen. Den vellykkede etablering af det åbne karvindue kræver en høj grad af kirurgisk dygtighed. Der skal udvises forsigtighed ved fjernelse af knoglen i cochlear sidevæggen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisering og analyse af blodgennemstrømning og iltforbruget i Nedsat mikrocirkulation: Ansøgning til en akut hepatitis model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

En ortotopisk Glioblastoma Mouse Model Fastholdelse Brain Parenkymalt fysiske begrænsninger og velegnet til Intravital To-foton mikroskopi

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Intravital Video Mikroskopi Målinger af Retinal blodgennemstrømningen i Mus

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Automatiseret Måling af mikrocirkulatorisk Blood Flow Velocity i lungemetastaser af rotter

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Evaluering af Planar-Cell-polaritet fænotyper i Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Kombineret Intravital mikroskopi og kontrast-forstærket ultralyd af musen Hindlimb at studere Insulin-induceret vasodilatation og muskel Perfusion

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Intravital mikroskopi og thrombus Induktion i øreflippen af ​​en hårløs mus

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

En kronisk hjerte iskæmi Model i svin ved hjælp af en Ameroid kvælerslange

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Samtidige Elektrokardiografi optagelse og Invasive blod pres måling i rotter

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Samtidige flow Cytometrisk karakterisering af flere celletyper hentet fra mus hjerne/rygmarv gennem forskellige homogenisering metoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...