Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
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Cette recherche a été soutenue par NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) et Medical Research Foundation de l’Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).

REMARQUE: Il s’agit d’une chirurgie de non-survie. Toutes les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Oregon Health & Science University (numéro d’approbation IACUC : TR01_IP00000968).
1. Préparation des cellules sanguines marquées par fluorescence
<ol><li>Anesthésier les souris donneuses (souris mâles C57BL/6J âgées de ~6 semaines) avec une injection intrap...

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system.">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).</li><li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow.">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li><li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo.">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li><li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

Cet article démontre comment les capillaires dans la paroi latérale cochléaire (et dans la strie vasculaire) d’un modèle murin peuvent être visualisés avec le marquage fluorophore dans une préparation vaisseau-fenêtre ouverte sous un système FIVM. Le modèle murin est largement utilisé et préféré comme modèle de mammifère pour étudier la santé et les maladies humaines. Le protocole décrit ici est une approche réalisable pour l’imagerie et l’étude du CoBF dans la paroi latérale de la souris (en ...

La fonction normale de la microcirculation dans la paroi cochléaire latérale (comprenant la majorité des capillaires du ligament spiralé et de la strie vasculaire) est d’une importance cruciale pour le maintien de la fonction auditive1. La CoBF anormale est impliquée dans la physiopathologie de nombreux troubles de l’oreille interne, y compris la perte auditive induite par le bruit, l’hydrops de l’oreille et la presbyacousie 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualisation du CoBF intravital permettra de mieux comprendre les liens entre la fonction auditive et la pathologie vasculaire cochléaire.
Bien que la complexité et l’emplacement de la cochlée dans l’os temporal empêchent la visualisation et la mesure directes du CoBF, diverses méthodes ont été développées pour l’évaluation du CoBF, notamment la débitmétrie laser-Doppler (LDF)10,11,12, l’imagerie par résonance magnétique (IRM)13, la microscopie intravitale à fluorescence (FIVM)14, la microendoscopie à fluorescence (FME)15, l’imagerie endoscopique par contraste de moucheture laser (LSCI)16 , et des approches basées sur l’injection de marqueurs marqués et de microsphères marquées radioactivement dans la circulation sanguine (microangiographie optique, OMAG)17,18,19,20. Cependant, aucune de ces méthodes n’a permis un suivi absolu en temps réel des changements dans le CoBF in vivo, à l’exception du FIVM. FIVM, en combinaison avec une fenêtre vasculaire dans la paroi cochléaire latérale, est une approche qui a été utilisée et validée chez le cobaye dans différentes conditions expérimentales par divers laboratoires14,21,22.
Une méthode FIVM a été établie avec succès pour étudier les changements structurels et fonctionnels de la microcirculation cochléaire chez la souris en utilisant l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran comme produit de contraste et un colorant de fluorescence - DiO (perchlorate de 3, 3′-dioctadécyloxacarbocyanine, vert) ou Dil (perchlorate de 1,1-dioctadécyl-3,3,3,3-tétraméthylindocarbocyanine, rouge) - pour prémarquer les cellules sanguines, visualiser les vaisseaux et suivre la vitesse du flux sanguin. Dans la présente étude, le protocole de cette méthode a été décrit pour l’imagerie et la quantification des changements dans le CoBF chez la souris dans des conditions normales et pathologiques (comme après une exposition au bruit). Cette technique donne au chercheur les outils nécessaires pour étudier les mécanismes sous-jacents du CoBF liés au dysfonctionnement auditif et à la pathologie de la strie vasculaire, en particulier lorsqu’il est appliqué en conjonction avec des modèles murins transgéniques facilement disponibles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

La transduction du son est métaboliquement exigeante, et la fonction normale de la microvascularisation dans la paroi latérale est essentielle pour maintenir le potentiel endocochléaire, le transport des ions et l’équilibre des fluides. Différentes formes de troubles auditifs impliqueraient une microcirculation anormale dans la cochlée. L’étude de la façon dont la pathologie du flux sanguin cochléaire (CoBF) affecte la fonction auditive est difficile en raison du manque de méthodes d’interrogatoire réalisables et de la difficulté d’accès à l’oreille interne. Une fenêtre vasculaire ouverte dans la paroi cochléaire latérale, combinée à la microscopie intravitale à fluorescence, a été utilisée pour étudier les changements de CoBF in vivo, mais surtout chez le cobaye et récemment chez la souris. Cet article et la vidéo associée décrivent la méthode de fenêtre de vaisseau ouvert pour visualiser le flux sanguin dans la cochlée de souris. Les détails comprennent 1) la préparation de la suspension de cellules sanguines marquées par fluorescence provenant de souris; 2) construction d’une fenêtre vasculaire ouverte pour la microscopie intravitale chez une souris anesthésiée, et 3) mesure de la vitesse et du volume du flux sanguin à l’aide d’un enregistrement hors ligne de l’imagerie. La méthode est présentée sous forme vidéo pour montrer comment utiliser l’approche de la fenêtre ouverte chez la souris pour étudier les changements structurels et fonctionnels dans la microcirculation cochléaire dans des conditions normales et pathologiques.

Après exposition chirurgicale des capillaires cochléaires de la paroi latérale (Figure 1), l’observation microscopique par fluorescence intravitale à haute résolution de cellules sanguines marquées par Dil dans des vaisseaux marqués FITC-dexton a été possible à travers une fenêtre vasculaire ouverte. La figure 2A est une image représentative prise sous FIVM qui montre les capillaires de la paroi latérale apex cochl...

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Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Une approche vaisseau-fenêtre ouverte utilisant des traceurs fluorescents fournit une résolution suffisante pour la mesure du débit sanguin cochléaire (CoBF). La méthode facilite l’étude des changements structurels et fonctionnels du CoBF chez la souris dans des conditions normales et pathologiques.

Mesure du débit sanguin strial dans la cochlée de souris à l’aide d’une fenêtre vasculaire ouverte et d’une microscopie à fluorescence intravitale

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

L’apport sanguin normal à la cochlée est d’une importance cruciale pour la maladie de Ménière, en particulier pour maintenir le potentiel cochléaire intérieur qui est la force motrice essentielle pour la transaction des cellules ciliées. Cette fonction de la circulation sanguine a été étroitement associée à différentes formes de perte auditive. Une meilleure compréhension du flux sanguin cochléaire permettra une prise en charge plus efficace des troubles auditifs résultant d’un dysfonctionnement du flux sanguin.Cependant, la mesure directe du débit sanguin est très très difficile en raison de la difficulté à évaluer l’oreille interne. Les techniques d’évaluation du débit sanguin cochléaire sont actuellement en cours de développement. Ici, nous démontrons l’une des méthodes récentes établies dans notre laboratoire fenêtre musculaire ouverte en accommodation avec un microscope à fluorescence à haute résolution pour réduire le flux sanguin cochléaire chez les petites espèces animales telles que la souris.L’application de cette technique avec des modèles de masse transgénétiques a le potentiel de faire progresser la recherche pour démêler les liens entre la fonction auditive et la pathologie liée au flux sanguin cochléaire dans le risque intravasculaire. Nos procédures doivent être menées avec prudence. En plus de l’hémorragie corporelle momentanée, les signes vitaux de l’animal, y compris la pression artérielle et le rythme cardiaque, doivent être surveillés pendant votre chirurgie.Commencez par recueillir environ un millimètre de sang dans l’héparine par ponction cardiaque. Centrifuger le sang à 3000 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Retirer le plasma, puis laver la pastille de cellules sanguines avec un millilitre de PBS trois fois par centrifugation à 3000 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.Marquez les cellules sanguines avec un millilitre de 20 micromolaires DiO ou Dil dans du PBS et incuber dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les cellules sanguines marquées avec un millilitre de PBS et centrifugez trois fois à 3000 fois G pendant trois minutes. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 30% d’hématocrite avec environ 0,9 millilitre de PBS avant l’injection.Préparez des instruments chirurgicaux stériles et une plate-forme d’imagerie et placez un coussin chauffant sous le rideau. Surveillez le mauvais réflexe et le tonus musculaire général des souris anesthésiées pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Placez l’animal sur le coussin chauffant chaud et sa queue dans le système de surveillance pour surveiller la pression artérielle et le rythme cardiaque.Maintenez la température rectale à 37 degrés Celsius et notez la pression artérielle systolique, la pression artérielle diastolique et la pression artérielle moyenne de l’animal dans l’état anesthésié. Ouvrez la bulle tympanique gauche par une approche latérale et ventrale au microscope en laissant la membrane tympanique et les osselets intacts. Faites une incision le long de la ligne médiane du cou de l’animal avec sa tête immobilisée pour minimiser les mouvements.Retirer la glande sous-mandibulaire gauche et le ventre postérieur du muscle digastrique et cautériser. Localisez et exposez la bulle osseuse en identifiant le muscle sternocléidomastoïdien et le nerf facial s’étendant antérieurement vers la bulle. Ouvrez la bulle osseuse avec une aiguille de calibre 30 et retirez soigneusement l’os environnant avec une pince chirurgicale pour fournir une vue claire de l’artère cochléaire et stapédienne avec sa marge médiale située sur le bord de la niche de la fenêtre ronde et provoquant une supériorité antérieure vers la fenêtre ovale.Utilisez une petite lame de couteau pour gratter l’os de la paroi latérale au milieu du sommet de la cochlée de la souris à environ 1,25 millimètre de l’apex jusqu’à ce qu’une fine tache soit fissurée. Retirez les copeaux d’os avec de petits crochets métalliques. Couvrir la fenêtre du récipient avec un glissement de couvercle coupé pour préserver les conditions physiologiques normales et fournir une vue optique pour l’enregistrement des images du navire.Faites une incision d’un centimètre le long de la veine saphène droite pour exposer le vaisseau. Infuser successivement 100 microlitres chacun de la solution FITC-Dextran et de la suspension de cellules sanguines dans l’animal à travers la veine saphène pour permettre la visualisation des vaisseaux sanguins et le suivi du flux sanguin. Observez le flux sanguin en temps réel sur un moniteur vidéo cinq minutes après l’injection.Imagez les vaisseaux sanguins à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un objectif à longue distance de travail et d’un boîtier de lampe contenant un filtre d’excitation à bandes multiples et un filtre d’émission compatible. Enregistrez la vidéo à l’aide d’une caméra numérique haute résolution en noir et blanc couplée à une charge acquérant plus de 350 images par vidéo. Assurer une analyse réussie de la vitesse d’écoulement.Mesurez le diamètre du navire à l’aide d’un logiciel approprié et déterminez la distance entre deux points fixes à travers le navire dans les images acquises. Ouvrez la vidéo du flux sanguin dans le logiciel et définissez l’échelle des images. Suivez les cellules sanguines colorées DiO sélectionnées à l’aide de la fonction de suivi.Utilisez ensuite la distance parcourue par les cellules et l’intervalle de temps entre les images de la vidéo pour calculer automatiquement la vitesse d’écoulement. Calculez le débit volumétrique à l’aide de l’équation donnée dans le manuscrit du texte. Pour créer le modèle d’exposition au bruit avant l’enregistrement du flux sanguin, placez les animaux dans des cages en treillis métallique et exposez-les à un bruit à large bande à un niveau de pression acoustique de 120 décibels dans une cabine d’exposition au bruit pendant trois heures.Puis pour trois heures supplémentaires le lendemain. Enregistrez le débit sanguin deux semaines après l’exposition au bruit. Après exposition chirurgicale des capillaires cochléaires dans la paroi latérale, l’observation microscopique par fluorescence intravitale à haute résolution des cellules sanguines marquées DiL dans les vaisseaux marqués FITC Dextran a été réalisée à travers une fenêtre de vaisseau ouverte.Les cellules sanguines marquées DiL dans les vaisseaux Stria marqués avec FITC Dextran sont montrées ici. Les cellules sanguines marquées par Dio marquées avec FITC Dextran montrent que la densité des vaisseaux du ligament spiralé est plus clairsemée que celle du Stria vascularis, plus dense. La MIV haute résolution montre les schémas de flux sanguin dans les groupes témoins et exposés au bruit.Le schéma perturbé de la circulation sanguine peut être vu dans les groupes exposés au bruit. Les anomalies comprenaient une réduction du diamètre du navire et une variation accrue du diamètre du navire. Les vitesses de flux sanguin dans les groupes témoins et exposés au bruit ont été calculées en suivant les racines des cellules sanguines marquées DiO.La vitesse et le volume sanguins dans le groupe exposé au bruit étaient significativement inférieurs à ceux du groupe témoin. La mise en place réussie de la fenêtre du vaisseau ouvert nécessite un haut degré de compétence chirurgicale. Des précautions doivent être prises lors de l’enlèvement de l’os de la paroi latérale cochléaire.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisation et analyse du flux sanguin et la consommation d&#39;oxygène dans la microcirculation hépatique: Application à un modèle de l&#39;hépatite aiguë

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Recherche

Médecine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Un modèle de souris orthotopique glioblastome maintien contraintes physiques et parenchyme cérébral Convient pour intravitale deux microscopie biphotonique

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Mesures microscopie intravitale Vidéo de la rétine débit sanguin chez les souris

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Mesure automatisée du flux sanguin Microcirculatory vitesse dans métastases pulmonaire des rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Évaluation de Planar-Cell-polarité phénotypes dans ciliopathie souris mutante cochlée

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Combiné la microscopie intravitale et échographie de contraste accentué des membres postérieurs souris pour étudier la vasodilatation induite par l’insuline et la Perfusion du Muscle

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

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Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Un modèle d’ischémie cardiaque chronique chez les porcs à l’aide d’un Constrictor Améroïde

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Enregistrement simultané de l’électrocardiographie et envahissantes sang pression mesure chez les Rats

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

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Caractérisation cytométrique simultanée des types de cellules multiples récupérées du cerveau de la souris / moelle épinière grâce à différentes méthodes d'homogénéisation

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...