Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
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Questa ricerca è stata supportata da NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) e Medical Research Foundation della Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).

NOTA: Questo è un intervento chirurgico di non sopravvivenza. Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state esaminate e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Oregon Health & Science University (numero di approvazione IACUC: TR01_IP00000968).
1. Preparazione delle cellule del sangue marcate con fluorescenza
<ol><li>Anestetizzare i topi donatori (topi maschi C57BL/6J di età ~6 settimane) con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di soluzione aneste...

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+[corrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research.">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li><li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention.">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li><li>Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow.">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li><li>Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders.">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).</li><li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants.">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li><li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser+Doppler:+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow.">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li><li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI.">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li><li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system.">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).</li><li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow.">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li><li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo.">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li><li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

Questo articolo dimostra come i capillari nella parete laterale cocleare (e nella stria vascularis) di un modello murino possono essere visualizzati con l'etichettatura fluoroforica in una preparazione di finestra del vaso aperta sotto un sistema FIVM. Il modello murino è ampiamente utilizzato e preferito come modello di mammifero per studiare la salute e le malattie umane. Il protocollo qui descritto è un approccio fattibile per l'imaging e lo studio del CoBF nella parete laterale del topo (in particolare nella stria ...

La normale funzione del microcircolo nella parete cocleare laterale (che comprende la maggior parte dei capillari nel legamento a spirale e nella stria vascolare) è di fondamentale importanza per il mantenimento della funzione uditiva1. Il CoBF anormale è implicato nella fisiopatologia di molti disturbi dell'orecchio interno, tra cui la perdita dell'udito indotta dal rumore, l'idrope dell'orecchio e la presbiacusia 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualizzazione del CoBF intravitale consentirà una migliore comprensione dei legami tra funzione uditiva e patologia vascolare cocleare.
Sebbene la complessità e la posizione della coclea all'interno dell'osso temporale precludano la visualizzazione diretta e la misurazione del CoBF, sono stati sviluppati vari metodi per la valutazione del CoBF tra cui la flussimetria laser-doppler (LDF)10,11,12, la risonanza magnetica (MRI)13, la microscopia intravitale a fluorescenza (FIVM)14, la microendoscopia a fluorescenza (FME)15, l'imaging endoscopico a contrasto laser speckle (LSCI)16 , e approcci basati sull'iniezione di marcatori marcati e microsfere marcate radioattivamente nel flusso sanguigno (microangiografia ottica, OMAG)17,18,19,20. Tuttavia, nessuno di questi metodi ha consentito il monitoraggio assoluto in tempo reale delle variazioni del CoBF in vivo, ad eccezione di FIVM. FIVM, in combinazione con una finestra del vaso nella parete cocleare laterale, è un approccio che è stato utilizzato e validato in cavie in diverse condizioni sperimentali da vari laboratori 14,21,22.
È stato stabilito con successo un metodo FIVM per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nella microcircolazione cocleare nel topo utilizzando isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano come mezzo di contrasto e un colorante di fluorescenza - DiO (3, 3′-dioctadeciloxacarbocianina perclorato, verde) o Dil (1,1-diottadecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina perclorato, rosso) - per premarcare le cellule del sangue, visualizzare i vasi e monitorare la velocità del flusso sanguigno. Nel presente studio, il protocollo di questo metodo è stato descritto per l'imaging e la quantificazione dei cambiamenti nel CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche (come dopo l'esposizione al rumore). Questa tecnica fornisce al ricercatore gli strumenti necessari per studiare i meccanismi alla base del CoBF correlati alla disfunzione uditiva e alla patologia nella stria vascolare, specialmente se applicata in combinazione con modelli murini transgenici prontamente disponibili.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

La trasduzione del suono è metabolicamente impegnativa e la normale funzione della microvascolarizzazione nella parete laterale è fondamentale per mantenere il potenziale endococleare, il trasporto ionico e l'equilibrio dei fluidi. Diverse forme di disturbi dell'udito sono segnalati per coinvolgere la microcircolazione anormale nella coclea. L'indagine su come la patologia del flusso sanguigno cocleare (CoBF) influisce sulla funzione uditiva è impegnativa a causa della mancanza di metodi di interrogazione fattibili e della difficoltà di accesso all'orecchio interno. Una finestra aperta del vaso nella parete cocleare laterale, combinata con la microscopia intravitale a fluorescenza, è stata utilizzata per studiare i cambiamenti di CoBF in vivo, ma soprattutto nella cavia e solo recentemente nel topo. Questo documento e il video associato descrivono il metodo della finestra del vaso aperto per visualizzare il flusso sanguigno nella coclea del topo. I dettagli includono 1) preparazione della sospensione di cellule del sangue marcata con fluorescenza dai topi; 2) costruzione di una finestra vasale aperta per microscopia intravitale in un topo anestetizzato e 3) misurazione della velocità e del volume del flusso sanguigno utilizzando una registrazione offline dell'imaging. Il metodo è presentato in formato video per mostrare come utilizzare l'approccio a finestra aperta nel topo per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nel microcircolo cocleare in condizioni normali e patologiche.

Dopo l'esposizione chirurgica dei capillari cocleari nella parete laterale (Figura 1), l'osservazione microscopica a fluorescenza intravitale ad alta risoluzione delle cellule del sangue marcate con Dil in vasi marcati con FITC era fattibile attraverso una finestra aperta del vaso. La Figura 2A è un'immagine rappresentativa scattata sotto FIVM che mostra i capillari della parete laterale dell'apice cocleare del topo. La lumina d...

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Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Un approccio a finestra vaso aperta che utilizza traccianti fluorescenti fornisce una risoluzione sufficiente per la misurazione del flusso sanguigno cocleare (CoBF). Il metodo facilita lo studio dei cambiamenti strutturali e funzionali del CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche.

Misurazione del flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Il normale apporto di sangue alla coclea è di fondamentale importanza per la malattia di Meniere della coclea, in particolare per il mantenimento del potenziale cocleare interno, che è la forza trainante essenziale per la transazione delle cellule ciliate. Questa funzione della circolazione sanguigna è stata strettamente associata a diverse forme di perdita dell'udito. Una migliore comprensione del flusso sanguigno cocleare consentirà una gestione più efficace dei disturbi dell'udito derivanti dalla disfunzione del flusso sanguigno.Tuttavia, la misurazione diretta del flusso sanguigno è molto impegnativa a causa della difficoltà di valutare l'orecchio interno. Le tecniche per valutare il flusso sanguigno cocleare sono attualmente ancora in fase di sviluppo. Qui dimostriamo uno dei recenti metodi stabiliti nel nostro laboratorio aprire la finestra muscolare in alloggi con microscopio a fluorescenza ad alta risoluzione per restringere il flusso sanguigno cocleare in piccole specie animali come il topo.L'applicazione di questa tecnica con modelli di massa transgenici ha il potenziale per far progredire la ricerca per svelare i legami tra la funzione uditiva e la patologia correlata al flusso sanguigno cocleare nel rischio intravascolare. Le nostre procedure devono essere condotte con cautela. Oltre all'emorragia momentanea del corpo, i segni vitali dell'animale, tra cui la pressione sanguigna e il battito cardiaco, devono essere monitorati durante l'intervento chirurgico.Inizia raccogliendo circa un millimetro di sangue nell'eparina mediante puntura cardiaca. Centrifugare il sangue a 3000 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il plasma, quindi lavare il pellet delle cellule del sangue con un millilitro di PBS tre volte mediante centrifugazione a 3000 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius.Etichettare le cellule del sangue con un millilitro di 20 micromolari DiO o Dil in PBS e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule del sangue marcate con un millilitro di PBS e centrifugare tre volte a 3000 volte G per tre minuti. Risospendere il pellet cellulare in ematocrito al 30% con circa 0,9 millilitri di PBS prima dell'iniezione.Preparare strumenti chirurgici sterili e piattaforma di imaging e posizionare una piastra riscaldante sotto il drappo. Monitorare il cattivo riflesso e il tono muscolare generale dei topi anestetizzati per verificare la profondità dell'anestesia. Posizionare l'animale sulla piastra riscaldante calda e la sua coda nel sistema di monitoraggio per il monitoraggio della pressione sanguigna e del battito cardiaco.Mantenere la temperatura rettale a 37 gradi Celsius e registrare la pressione sanguigna sistolica dell'animale, la pressione sanguigna diastolica e la pressione sanguigna media nella condizione anestetizzata. Aprire la bolla timpanica sinistra tramite un approccio laterale e vennale al microscopio stereo lasciando intatta la membrana timpanica e gli ossicini. Fai un'incisione lungo la linea mediana del collo dell'animale con la testa immobilizzata per ridurre al minimo il movimento.Rimuovere la ghiandola sottomandibolare sinistra e la pancia posteriore del muscolo digastrico e cauterizzare. Localizzare ed esporre la bulla ossea identificando il muscolo sternocleidomastoideo e il nervo facciale che si estende anteriormente verso la bolla. Aprire la bolla ossea con un ago calibro 30 e rimuovere con attenzione l'osso circostante con una pinzetta chirurgica per fornire una visione chiara dell'arteria cocleare e stapediale con il suo margine mediale che giace oltre il bordo della nicchia rotonda della finestra e causa superiore anteriore verso la finestra ovale.Utilizzare una piccola lama di coltello per raschiare l'osso della parete laterale all'apice della coclea del topo a circa 1,25 millimetri dall'apice fino a quando un punto sottile non si incrina. Rimuovere i trucioli ossei con piccoli ganci metallici. Coprire il finestrino della nave con una linguetta di copertura tagliata per preservare le normali condizioni fisiologiche e fornire una vista ottica per la registrazione delle immagini della nave.Fare un'incisione di un centimetro lungo la vena safena destra per esporre il vaso. Infondere successivamente 100 microlitri ciascuno della soluzione FITC-Dextran e la sospensione di cellule del sangue nell'animale attraverso la vena safena per consentire la visualizzazione dei vasi sanguigni e il monitoraggio del flusso sanguigno. Osservare il flusso sanguigno in tempo reale su un monitor video cinque minuti dopo l'iniezione.Immagini dei vasi sanguigni utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo a lunga distanza di lavoro e un alloggiamento della lampada contenente un filtro di eccitazione a banda multipla e un filtro di emissione compatibile. Registra il video utilizzando una fotocamera digitale in bianco e nero ad alta risoluzione che acquisisce più di 350 immagini per video. Per garantire un'analisi corretta della velocità del flusso.Misurare il diametro del recipiente utilizzando un software appropriato e determinare la distanza tra due punti fissi attraverso il recipiente nelle immagini acquisite. Apri il video del flusso sanguigno nel software e imposta la scala delle immagini. Tenere traccia delle cellule del sangue colorate con DiO selezionate utilizzando la funzione di tracciamento.Quindi utilizzare la distanza spostata dalle celle e l'intervallo di tempo tra i fotogrammi dell'immagine nel video per il calcolo automatico della velocità del flusso. Calcolare la portata volumetrica utilizzando l'equazione fornita nel manoscritto testuale. Per creare il modello di esposizione al rumore prima della registrazione del flusso sanguigno, posizionare gli animali in gabbie di rete metallica ed esporli al rumore a banda larga a 120 decibel di pressione sonora in una cabina di esposizione sonora per tre ore.Poi per altre tre ore il giorno successivo. Registra il flusso sanguigno due settimane dopo l'esposizione al rumore. Dopo l'esposizione chirurgica dei capillari cocleari nella parete laterale, l'osservazione microscopica a fluorescenza ad alta risoluzione intravitale delle cellule del sangue marcate con DiL nei vasi marcati con destrano FITC è stata eseguita attraverso una finestra vasale aperta.Le cellule del sangue marcate con DiL nei vasi Stria marcati con FITC Dextran sono mostrate qui. Le cellule del sangue marcate con Dio marcate con FITC Dextran mostrano che la densità vascolare del legamento a spirale è più rada di quella della più densa Stria vascularis. IVM ad alta risoluzione mostra i modelli di flusso sanguigno nei gruppi di controllo e esposti al rumore.Il modello disturbato della circolazione sanguigna può essere visto nei gruppi esposti al rumore. Le anomalie includevano la riduzione del diametro del vaso e l'aumento della variazione del diametro del vaso. Le velocità del flusso sanguigno nei gruppi di controllo e esposti al rumore sono state calcolate monitorando le radici delle cellule del sangue marcate con DiO.La velocità e il volume del sangue nel gruppo esposto al rumore erano significativamente inferiori rispetto al gruppo di controllo. La creazione di successo della finestra aperta della nave richiede un alto grado di abilità chirurgica. Bisogna fare attenzione nella rimozione dell'osso della parete laterale cocleare.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Ricerca

Medicina

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