Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

本研究は、NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi)、NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi)、NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi)、およびオレゴン健康科学大学(OHSU)の医学研究財団(X.Shi)の支援を受けました。

注:これは非生存手術です。動物の使用を含むすべての手順は、オレゴン健康科学大学の施設動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました(IACUC承認番号:TR01_IP00000968)。
1.蛍光標識血球の調製
<ol><li>ドナーマウス(~6週齢の雄C57BL/6Jマウス)にケタミン/キシラジン麻酔液(5 mL/kg、 材料表参照)の腹腔内注射を麻酔します。 注:この麻酔プロト?...

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+[corrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research.">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li><li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention.">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li><li>Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow.">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li><li>Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders.">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).</li><li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants.">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li><li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser+Doppler:+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow.">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li><li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI.">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li><li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system.">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).</li><li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow.">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li><li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo.">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li><li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

この論文は、マウスモデルの蝸牛側壁(および脈理血管)の毛細血管を、FIVMシステム下での開放血管窓調製物における蛍光色素標識でどのように視覚化できるかを示しています。マウスモデルは、ヒトの健康および疾患を調査するための哺乳類モデルとして広く使用され、好ましい。ここで説明するプロトコルは、FIVMシステム下の開いた血管窓を使用して、マウス側壁(特に脈条体)におけるCoBF...

外側蝸牛壁(らせん靭帯と脈条血管の毛細血管の大部分を含む)における微小循環の正常な機能は、聴覚機能を維持するために非常に重要です1。異常なCoBFは、騒音性難聴、耳水腫、老人性難聴など、多くの内耳障害の病態生理に関与しています2,3,4,5,6,7,8,9。生体内CoBFの可視化により、聴覚機能と蝸牛血管病理との関連をよりよく理解できるようになります。
側頭骨内の蝸牛の複雑さと位置により、CoBFを直接可視化および測定することはできませんが、レーザードップラー流量測定(LDF)10、11、12、磁気共鳴画像法(MRI)13、蛍光生体内顕微鏡(FIVM)14、蛍光マイクロ内視鏡検査(FME)15、内視鏡レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)16など、CoBFの評価のためのさまざまな方法が開発されています。、および標識マーカーおよび放射性タグ付きミクロスフェアの血流への注入に基づくアプローチ(光学的微小血管造影、OMAG)17,18,19,20。しかし、これらの方法はいずれも、FIVMを除いて、in vivoでのCoBFの変化の絶対的なリアルタイム追跡を可能にしていません。FIVMは、外側蝸牛壁の血管窓と組み合わせて、様々な実験室14、21、22によって異なる実験条件下でモルモットにおいて使用および検証されてきたアプローチである14、21、22。
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランを造影剤とし、蛍光色素(DiO(3,3'-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩、緑)またはDil(1,1-ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、赤)を使用して、マウスの蝸牛微小循環の構造的および機能的変化を研究するためのFIVM法を確立することに成功しました。本研究では、正常および病理学的条件(ノイズ曝露後など)でのマウスにおけるCoBFの変化を画像化および定量化するためのこの方法のプロトコルが記載されている。この技術は、特に容易に入手可能なトランスジェニックマウスモデルと組み合わせて適用された場合、血管線条の聴覚機能障害および病理に関連するCoBFの根底にあるメカニズムを調査するために必要なツールを研究者に提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

音の伝達は代謝的に要求が厳しく、側壁の微小血管系の正常な機能は、内視鏡電位、イオン輸送、および体液バランスを維持するために重要です。さまざまな形態の聴覚障害が、蝸牛の異常な微小循環を伴うことが報告されています。人工内耳血流(CoBF)の病理が聴覚機能にどのように影響するかの調査は、実行可能な尋問方法がなく、内耳へのアクセスが困難であるため、困難です。外側蝸牛壁の開いた血管窓は、蛍光生体内顕微鏡と組み合わせて、in vivoでのCoBF変化の研究に使用されてきましたが、主にモルモットで、 ごく最近マウスで使用されてきました。この論文と関連するビデオでは、マウス蝸牛の血流を視覚化するための開放血管窓法について説明しています。詳細には、1)マウス由来の蛍光標識血球懸濁液の調製;2)麻酔マウスにおける生体内顕微鏡観察のための開放血管窓の構築、および3)画像のオフライン記録を使用した血流速度と体積の測定。この方法は、マウスのオープンウィンドウアプローチを使用して、正常および病理学的条件下での蝸牛微小循環の構造的および機能的変化を調べる方法を示すためにビデオ形式で提示されます。

側壁の蝸牛毛細血管の外科的曝露後(図1)、FITCデキストラン標識血管内のディル標識血球の生体内高解像度蛍光顕微鏡観察は、開いた血管窓を通して実行可能でした。図2Aは、マウス蝸牛頂部・中回側壁の毛細血管を示すFIVM下で撮影した代表的な画像である。これらの血管の発光は、血漿と混合されたFITCデキストランの蛍?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

蛍光トレーサーを使用した開放血管窓アプローチは、人工内耳血流(CoBF)測定に十分な分解能を提供します。この方法は、正常および病理学的条件下でのマウスにおけるCoBFの構造的および機能的変化の研究を容易にする。

開放血管窓と生体内蛍光顕微鏡を用いたマウス蝸牛の心房血流測定

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

蝸牛への正常な血液供給は、特に有毛細胞取引の重要な原動力である屋内蝸牛の可能性を維持するために、蝸牛メニエール病にとって非常に重要です。血液循環のこの機能は、さまざまな形態の難聴と密接に関連しています。人工内耳の血流をよりよく理解することで、血流障害に起因する聴覚障害をより効果的に管理できるようになります。しかし、直接血流測定は、内耳を評価することが困難なため、非常に困難です。人工内耳血流を評価する技術は現在開発中です。本研究では、マウスなどの小動物種の人工内耳血流を狭くするために、高解像度蛍光顕微鏡で筋肉窓を開放する研究室で確立された最近の方法の1つを示します。この手法をトランスジェネティック質量モデルに適用することで、血管内リスクにおける蝸牛血流に関連する聴覚機能と病理との関連を解明する研究が進む可能性があります。私たちの手順は慎重に行われるべきです。瞬間的な体の出血に加えて、血圧や心拍などの動物のバイタルサインを手術中に監視する必要があります。心臓穿刺によってヘパリン中の約1ミリメートルの血液を採取することから始めます。血液を摂氏4度で3分間3000倍Gで遠心分離します。血漿を除去し、次いで、摂氏4度で3分間、3000倍Gで遠心分離することにより、血球ペレットを1ミリリットルのPBSで3回洗浄する。PBS中の1ミリリットルの20マイクロモルDiOまたはDilで血球を標識し、室温で30分間暗所でインキュベートします。標識した血球を1ミリリットルのPBSで洗浄し、3000倍Gで3分間3回遠心分離します。注射前に、細胞ペレットを約0.9ミリリットルのPBSを含む30%ヘマトクリット値に再懸濁します。滅菌手術器具とイメージングプラットフォームを準備し、ドレープの下に加熱パッドを置きます。麻酔をかけたマウスの反射不良と一般的な筋緊張を監視して、麻酔の深さを確認します。血圧と心拍を監視するためのモニターシステムの暖かい加熱パッドとその尾の上に動物を置きます。直腸温を摂氏37度に維持し、麻酔状態で動物の収縮期血圧、拡張期血圧、および平均血圧を記録します。鼓膜と耳小骨をそのまま残した実体顕微鏡下での側方および腹側のアプローチを介して左鼓室を開きます。動きを最小限に抑えるために、頭を固定した状態で動物の首の正中線に沿って切開します。左下顎下腺と顎二腹筋の後腹を切除し、焼灼します。胸鎖乳突筋と顔面神経が胸骨に向かって前方に伸びていることを特定することにより、骨ブラを見つけて露出させます。30ゲージの針で骨ブラを開き、外科用ピンセットで周囲の骨を慎重に取り除き、蝸牛と蝸牛動脈をはっきりと見ることができ、内側の縁が丸い窓のニッチの端にあり、楕円形の窓に向かって前方が優れています。小さなナイフの刃を使用して、マウス蝸牛の頂点中央ターンで、頂点から約1.25ミリメートルの外側壁の骨を、薄い斑点が割れるまでこすります。小さなワイヤーフックで骨片を取り除きます。通常の生理学的状態を維持し、血管画像を記録するための光学ビューを提供するために、カットカバースリップで血管窓を覆います。右伏在静脈に沿って1センチの切開を行い、血管を露出させます。FITC-デキストラン溶液と血球懸濁液を伏在静脈から動物にそれぞれ100マイクロリットル連続注入し、血管の可視化と血流の追跡を可能にします。注射の5分後にビデオモニターで血流をリアルタイムで観察します。作動距離の長い対物レンズと、多帯域励起フィルターと互換性のある発光フィルターを含むランプハウジングを備えた蛍光顕微鏡を使用して血管を画像化します。高解像度デジタル白黒電荷結合デバイスカメラを使用してビデオを録画し、ビデオごとに350を超える画像を取得します。流速の解析を成功させるため。適切なソフトウェアを使用して血管の直径を測定し、取得した画像で血管を横切る2つの固定点間の距離を決定します。ソフトウェアで血流のビデオを開き、画像のスケールを設定します。追跡機能を使用して、選択したDiO染色血球を追跡します。次に、セルが移動した距離とビデオ内の画像フレーム間の時間間隔を使用して、流速を自動計算します。テキスト原稿に与えられた式を使用して体積流量を計算します。血流記録の前に騒音暴露モデルを作成するには、動物を金網のケージに入れ、音暴露ブースで120デシベルの音圧レベルで3時間広帯域騒音にさらします。その後、翌日さらに3時間。騒音暴露の2週間後に血流を記録します。側壁の蝸牛毛細血管の外科的曝露後、FITCデキストラン標識血管内のDiL標識血球の生体内高分解能蛍光顕微鏡観察を、開いた血管窓を通して行った。FITCデキストランで標識された線条血管内のDiL標識血球をここに示します。FITCデキストランで標識されたDio標識血球は、らせん靭帯の血管密度が、より密度の高い脈理血管密度よりもまばらであることを示しています。高分解能IVMは、対照群および騒音暴露群の血流パターンを示す。血液循環の乱れたパターンは、ノイズにさらされたグループに見られます。異常には、血管の直径の減少と血管の直径のばらつきの増加が含まれていました。対照群および騒音暴露群における血流速度は、DiO標識血球の根を追跡することによって計算した。騒音曝露群の血液速度および体積は、対照群よりも有意に低かった。開いた血管窓の確立を成功させるには、高度な外科的スキルが必要です。蝸牛側壁の骨を取り除く際には注意が必要です。

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

肝微小循環における血流と酸素消費量の可視化と分析：急性肝炎モデルへの応用

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

ラットの肺転移における微小循環血流速度の自動測定

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

インスリン依存性血管拡張や筋肉の血流を研究する生体顕微鏡観察とマウスの後肢の造影超音波検査

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

ヘアレスマウスの耳たぶにおける生体顕微鏡および血栓誘導

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

アメロイド収縮を使用して豚の慢性心筋虚血モデル

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

心電図の同時記録と侵襲的血圧ラットにおける測定

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...