Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

이 연구는 NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) 및 Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi)의 Medical Research Foundation의 지원을 받았습니다.

참고: 이것은 생존이 아닌 수술입니다. 동물 사용과 관련된 모든 절차는 Oregon Health & Science University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC 승인 번호 : TR01_IP00000968)에서 검토하고 승인했습니다.
1. 형광표지된 혈액세포의 제조
<ol><li>케타민/자일라진 마취액(5mL/kg, 재료 표 참조)을 복강내(i.p.) 주사하여 기증자 마우스(수컷 C57BL/6J ~6주 된 수컷 C5BL/J 마우스)를 마취합...

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+[corrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research.">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li><li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders.">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).</li><li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants.">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li><li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo.">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li><li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

이 논문은 마우스 모델의 달팽이관 측벽(및 선조체 혈관)에 있는 모세혈관이 FIVM 시스템 하에서 열린 혈관 창 준비에서 형광단 라벨링으로 시각화될 수 있는 방법을 보여줍니다. 마우스 모델은 널리 사용되고 인간의 건강 및 질병을 조사하기 위한 포유동물 모델로서 선호된다. 여기에 설명된 프로토콜은 FIVM 시스템 하에서 열린 혈관 창을 사용하여 마우스 측벽(특히 선조체 혈관에서)에서 CoBF를 이...

외측 달팽이관 벽의 미세 순환의 정상적인 기능(나선형 인대 및 선조체 혈관에 있는 모세혈관의 대부분을 구성)은청력 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다1. 비정상적인 CoBF는 소음 유발성 난청, 귀 수종 및 노안 2,3,4,5,6,7,8,9를 포함한 많은 내이 장애의 병태생리학과 관련이 있습니다. 생체 내 CoBF의 시각화는 청력 기능과 달팽이관 혈관 병리 사이의 연관성을 더 잘 이해할 수 있게 해줍니다.
측두골 내 달팽이관의 복잡성과 위치로 인해 CoBF의 직접적인 시각화 및 측정이 불가능하지만 레이저 도플러 유량 측정(LDF)10,11,12, 자기 공명 영상(MRI)13, 형광 생체 내 현미경(FIVM)14, 형광 미세 내시경(FME)15, 내시경 레이저 스페클 대비 이미징(LSCI)16을 포함한 다양한 방법이 CoBF 평가를 위해 개발되었습니다. , 표지 된 마커 및 방사성 태그 된 마이크로 스피어를 혈류에 주입하는 접근법 (광학 미세 혈관 조영술, OMAG) 17,18,19,20. 그러나 이러한 방법 중 어느 것도 FIVM을 제외하고 생체 내 CoBF의 변화를 절대적으로 실시간으로 추적할 수 없었습니다. FIVM은 측면 달팽이관 벽의 혈관 창과 결합하여 다양한 실험실 14,21,22에 의해 다양한 실험 조건 하에서 기니피그에서 사용되고 검증 된 접근법입니다.
형광 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란을 조영제로 사용하고 형광 염료(DiO(3'-디옥타데실록사카르보시아닌 과염소산염, 녹색) 또는 딜(1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염, 빨간색)을 사용하여 마우스의 달팽이관 미세 순환의 구조적 및 기능적 변화를 연구하기 위한 FIVM 방법이 성공적으로 확립되었습니다. 본 연구에서이 방법의 프로토콜은 정상 및 병리학 적 상태 (예 : 소음 노출 후)에서 마우스의 CoBF 변화를 이미징하고 정량화하기 위해 설명되었습니다. 이 기술은 연구자에게 특히 쉽게 사용할 수있는 형질 전환 마우스 모델과 함께 적용 할 때 선조체 혈관의 청력 기능 장애 및 병리와 관련된 CoBF의 기본 메커니즘을 조사하는 데 필요한 도구를 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

소리의 변환은 대사적으로 까다로우며, 측벽에 있는 미세혈관구조의 정상적인 기능은 내달팽이관 전위, 이온 수송 및 체액 균형을 유지하는 데 중요합니다. 다양한 형태의 청력 장애가 달팽이관의 비정상적인 미세 순환을 수반하는 것으로 보고됩니다. 달팽이관 혈류(CoBF) 병리가 청력 기능에 미치는 영향에 대한 조사는 실현 가능한 심문 방법이 부족하고 내이에 접근하기 어렵기 때문에 어렵습니다. 형광 생체 내 현미경과 결합 된 측면 달팽이관 벽의 열린 혈관 창은 생체 내에서 CoBF 변화를 연구하는 데 사용되었지만 대부분 기니피그에서, 최근에야 마우스에서 사용되었습니다. 이 논문과 관련 비디오는 마우스 달팽이관의 혈류를 시각화하기위한 열린 혈관 창 방법을 설명합니다. 상세는 1) 마우스로부터 형광 표지된 혈구 현탁액의 제조; 2) 마취된 마우스에서 생체내 현미경 검사를 위한 개방 혈관 창의 구성, 및 3) 영상의 오프라인 기록을 이용한 혈류 속도 및 부피의 측정. 이 방법은 정상 및 병리학적 조건에서 달팽이관 미세 순환의 구조적 및 기능적 변화를 조사하기 위해 마우스에서 열린 창 접근 방식을 사용하는 방법을 보여주기 위해 비디오 형식으로 제공됩니다.

측벽에 있는 달팽이관 모세혈관의 외과적 노출 후(그림 1), 열린 혈관 창을 통해 FITC-덱스트란 표지된 혈관에서 딜 표지된 혈액 세포의 생체 내 고해상도 형광 현미경 관찰이 가능했습니다. 도 2A는 마우스 달팽이관 정점-중간 회전 측벽의 모세혈관을 보여주는 FIVM 하에서 촬영한 대표적인 이미지이다. 이 혈관의 루미나는 혈장과...

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Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

형광 추적자를 사용하는 개방형 혈관 창 접근 방식은 달팽이관 혈류(CoBF) 측정에 충분한 분해능을 제공합니다. 이 방법은 정상 및 병리학 적 조건에서 마우스에서 CoBF의 구조적 및 기능적 변화에 대한 연구를 용이하게합니다.

열린 혈관 창과 생체 내 형광 현미경을 사용한 마우스 달팽이관의 심방 혈류 측정

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

달팽이관으로의 정상적인 혈액 공급은 달팽이관 메니 에르 병, 특히 유모 세포 거래의 필수 원동력 인 실내 달팽이관 잠재력을 유지하는 데 매우 중요합니다. 이 혈액 순환 기능은 다양한 형태의 청력 손실과 밀접한 관련이 있습니다. 달팽이관 혈류를 더 잘 이해하면 혈류 기능 장애로 인한 청력 장애를 보다 효과적으로 관리할 수 있습니다.그러나 직접적인 혈류 측정은 내이를 평가하기가 어렵 기 때문에 매우 어렵습니다. 인공와우 혈류를 평가하는 기술은 현재 개발 중입니다. 여기에서는 마우스와 같은 작은 동물 종의 달팽이관 혈류를 좁히기 위해 고해상도 형광 현미경으로 실험실의 열린 근육 창에서 확립 된 최근 방법 중 하나를 시연합니다.이 기술을 전이유전학적 질량 모델에 적용하면 청력 기능과 혈관 내 위험에서 달팽이관 혈류와 관련된 병리학 사이의 연관성을 밝히기 위한 연구가 발전할 가능성이 있습니다. 우리의 절차는 신중하게 수행되어야합니다. 일시적인 신체 출혈 외에도 수술 중에 혈압 및 심장 박동을 포함한 동물의 활력 징후를 모니터링해야합니다.심장 천자에 의해 헤파린에서 약 1 밀리미터의 혈액을 수집하는 것으로 시작하십시오. 섭씨 4도에서 3 분 동안 3000 배 G로 혈액을 원심 분리합니다. 혈장을 제거한 후, 혈액 세포 펠릿을 PBS 1 밀리리터로 섭씨 4도에서 3 분 동안 3000 배 G에서 3 회 원심 분리하여 3 회 세척한다.PBS에서 20 마이크로 몰 DiO 또는 Dil의 1 밀리리터로 혈액 세포를 표지하고 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 표지 된 혈액 세포를 PBS 1 밀리리터로 씻고 3000 배 G에서 3 분 동안 3 회 원심 분리합니다. 주사하기 전에 약 0.9 밀리리터의 PBS로 30 % 헤마토크릿에 세포 펠릿을 재현 탁하십시오.멸균 수술 기구와 이미징 플랫폼을 준비하고 커튼 아래에 가열 패드를 놓습니다. 마취 된 마우스의 불량한 반사 및 일반적인 근육 톤을 모니터링하여 마취의 깊이를 확인하십시오. 동물을 따뜻한 가열 패드에 놓고 꼬리를 모니터 시스템에 두어 혈압과 심장 박동을 모니터링하십시오.직장 온도를 섭씨 37도로 유지하고 마취 상태에서 동물의 수축기 혈압, 이완기 혈압 및 평균 혈압을 기록합니다. 실체 현미경으로 측면 및 복부 접근을 통해 왼쪽 고막 수포를 열어 고막과 이소골을 그대로 둡니다. 움직임을 최소화하기 위해 머리를 고정시킨 상태에서 동물의 목 정중선을 따라 절개하십시오.왼쪽 하악선과 이위 근육의 후배를 제거하고 소작하십시오. 흉쇄 유돌근과 수포를 향해 앞쪽으로 뻗어 있는 안면 신경을 식별하여 뼈 수포를 찾아 노출시킵니다. 30 게이지 바늘로 뼈 수포를 열고 수술 용 핀셋으로 주변 뼈를 조심스럽게 제거하여 달팽이관 및 등골 동맥을 명확하게 볼 수 있도록 내측 여백이 둥근 창 틈새의 가장자리 위에 놓여 타원형 창쪽으로 앞쪽으로 상급합니다.작은 칼날을 사용하여 얇은 반점이 갈라질 때까지 정점에서 약 1.25mm 떨어진 마우스 달팽이관의 정점 중간 회전에서 측벽 뼈를 긁어냅니다. 작은 와이어 후크로 뼈 조각을 제거하십시오. 정상적인 생리적 조건을 유지하고 혈관 이미지 기록을 위한 광학 보기를 제공하기 위해 절단 덮개 슬립으로 용기 창을 덮습니다.혈관을 노출시키기 위해 오른쪽 복재 정맥을 따라 1cm 절개를하십시오. 복재 정맥을 통해 각각 100마이크로리터의 FITC-덱스트란 용액과 혈액 세포 현탁액을 동물에 연속적으로 주입하여 혈관을 시각화하고 혈류를 추적할 수 있습니다. 주사 후 5분 후에 비디오 모니터로 실시간으로 혈류를 관찰한다.긴 작동 거리 대물렌즈와 다중 대역 여기 필터 및 호환 가능한 방출 필터가 포함된 램프 하우징이 장착된 형광 현미경을 사용하여 혈관을 이미지화합니다. 비디오 당 350 개 이상의 이미지를 획득하는 고해상도 디지털 흑백 충전 결합 장치 카메라를 사용하여 비디오를 녹화합니다. 유속의 성공적인 분석을 보장합니다.적절한 소프트웨어를 사용하여 용기 직경을 측정하고 획득한 이미지에서 용기를 가로지르는 두 고정 지점 사이의 거리를 결정합니다. 소프트웨어에서 혈류 비디오를 열고 이미지의 크기를 설정합니다. 추적 기능을 사용하여 선택된 DiO 염색 혈액 세포를 추적합니다.그런 다음 유속의 자동 계산을 위해 비디오가 이동한 거리와 이미지 프레임 사이의 시간 간격을 사용합니다. 텍스트 원고에 주어진 방정식을 사용하여 체적 흐름을 계산하십시오. 혈류 기록 전에 소음 노출 모델을 만들려면 동물을 철망 케이지에 넣고 소음 노출 부스에서 120 데시벨 음압 수준의 광대역 소음에 3 시간 동안 노출시킵니다.그런 다음 다음날 추가로 3 시간 동안. 소음 노출 2 주 후 혈류를 기록하십시오. 측벽의 달팽이관 모세혈관의 외과적 노출 후, 열린 혈관 창을 통해 FITC 덱스트란 표지된 혈관에서 DiL 표지된 혈액 세포의 생체 내 고해상도 형광 현미경 관찰을 수행했습니다.FITC 덱스트란으로 표지된 스트리아 혈관의 DiL 표지된 혈액 세포가 여기에 표시됩니다. FITC 덱스 트란으로 표지 된 Dio 표지 된 혈액 세포는 나선형 인대의 혈관 밀도가 밀도가 높은 선조 혈관보다 희박하다는 것을 보여줍니다. 고해상도 IVM은 대조군 및 소음 노출 그룹의 혈류 패턴을 보여줍니다.혈액 순환의 방해 패턴은 소음 노출 그룹에서 볼 수 있습니다. 이상에는 용기 직경 감소와 용기 직경의 변동 증가가 포함되었습니다. 대조군 및 소음 노출 그룹의 혈류 속도는 DiO 표지된 혈액 세포의 뿌리를 추적하여 계산하였다.소음 노출 그룹의 혈액 속도와 부피는 대조군보다 유의하게 낮았습니다. 열린 혈관 창을 성공적으로 설치하려면 높은 수준의 수술 기술이 필요합니다. 달팽이관 측벽의 뼈를 제거 할 때주의를 기울여야합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

급성 간염 모델 신청 : 시각화와 간장 Microcirculation의 혈류와 산소 소비 분석

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

연구

의학

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

쥐의 폐 전이의 미세 혈류 속도의 자동 측정

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 마우스 Hindlimb의 인슐린 유도 된 혈관과 근육 관류 결합

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

털이 마우스의 귓불에서 생체 내에 현미경 및 혈전 유도

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Ameroid 압축을 사용 하 여 돼지에서 만성 심장 허 혈 모델

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

동시 심전도 기록 및 침략 적 혈액 압력 측정 쥐에

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...