Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) og Medical Research Foundation fra Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).

MERK: Dette er en ikke-overlevelsesoperasjon. Alle prosedyrer som involverer bruk av dyr ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Oregon Health &Science University (IACUC godkjenningsnummer: TR01_IP00000968).
1. Fremstilling av fluorescerende merkede blodceller
<ol><li>Bedøv donormusene (mannlige C57BL/6J-mus i alderen ~6 uker) med en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av ketamin/xylazinbedøvelsesløsning (5 ml/kg, se materialtabellen)....

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+[corrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research.">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li><li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention.">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li><li>Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow.">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li><li>Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders.">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).</li><li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants.">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li><li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser+Doppler:+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow.">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li><li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI.">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li><li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system.">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).</li><li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow.">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li><li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo.">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li><li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

Dette papiret demonstrerer hvordan kapillærene i cochlear lateral veggen (og i stria vascularis) av en musemodell kan visualiseres med fluoroformerking i et åpent fartøy-vindu forberedelse under et FIVM-system. Musmodell er mye brukt og foretrukket som en pattedyrmodell for å undersøke menneskers helse og sykdom. Protokollen beskrevet her er en mulig tilnærming for avbildning og undersøkelse av CoBF i musens sidevegg (spesielt i stria vascularis) ved bruk av et åpent fartøyvindu under FIVM-system Metoden gir til...

Normal funksjon av mikrosirkulasjonen i den laterale cochleaveggen (som omfatter flertallet av kapillærene i spiralligamentet og stria vascularis) er kritisk viktig for å opprettholde hørselsfunksjon1. Unormal CoBF er involvert i patofysiologien til mange indre øreforstyrrelser, inkludert støyindusert hørselstap, ørehydrops og presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisering av intravital CoBF vil muliggjøre en bedre forståelse av sammenhengen mellom hørselsfunksjon og cochlear vaskulær patologi.
Selv om kompleksiteten og plasseringen av sneglehuset i tinningbenet utelukker direkte visualisering og måling av CoBF, er det utviklet ulike metoder for vurdering av CoBF, inkludert laserdoppler-flowmetri (LDF)10,11,12, magnetisk resonansavbildning (MRI)13, fluorescens intravital mikroskopi (FIVM)14, fluorescensmikroskopi (FME)15, endoskopisk laserspekkelkontrastavbildning (LSCI)16 , og tilnærminger basert på injeksjon av merkede markører og radioaktivt merkede mikrosfærer i blodet (optisk mikroangiografi, OMAG)17,18,19,20. Ingen av disse metodene har imidlertid aktivert absolutt sanntidssporing av endringer i CoBF in vivo, med unntak av FIVM. FIVM, i kombinasjon med et fartøyvindu i den laterale cochlearveggen, er en tilnærming som har blitt brukt og validert i marsvin under forskjellige eksperimentelle forhold av ulike laboratorier 14,21,22.
En FIVM-metode ble vellykket etablert for å studere strukturelle og funksjonelle endringer i cochlear mikrosirkulasjonen i mus ved bruk av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -dextran som kontrastmedium og et fluorescensfargestoff - enten DiO (3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate, green) eller Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, red)-for forhåndsmerking av blodceller, visualisering av kar og sporing av blodstrømningshastighet. I denne studien er protokollen for denne metoden beskrevet for avbildning og kvantifisering av endringer i CoBF hos mus under normale og patologiske forhold (for eksempel etter støyeksponering). Denne teknikken gir forskeren verktøyene som trengs for å undersøke de underliggende mekanismene til CoBF relatert til hørselsdysfunksjon og patologi i stria vascularis, spesielt når de brukes sammen med lett tilgjengelige transgene musemodeller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

Transduksjon av lyd er metabolsk krevende, og mikrovaskulaturens normale funksjon i sideveggen er avgjørende for å opprettholde endokokrometarpotensial, ionetransport og væskebalanse. Ulike former for hørselsforstyrrelser er rapportert å involvere unormal mikrosirkulasjon i sneglehuset. Undersøkelse av hvordan cochlear blodstrøm (CoBF) patologi påvirker hørselsfunksjonen er utfordrende på grunn av mangel på gjennomførbare avhørsmetoder og vanskeligheten med å få tilgang til det indre øret. Et åpent karvindu i den laterale sneglehusveggen, kombinert med fluorescens intravital mikroskopi, har blitt brukt til å studere CoBF-endringer in vivo, men mest hos marsvin og først nylig i musen. Dette papiret og tilhørende video beskriver den åpne fartøy-vindusmetoden for å visualisere blodstrømmen i musesneglehuset. Detaljer inkluderer 1) fremstilling av fluorescerende merket blodcellesuspensjon fra mus; 2) konstruksjon av et åpent fartøyvindu for intravital mikroskopi i en bedøvet mus, og 3) måling av blodstrømningshastighet og volum ved hjelp av et offline opptak av avbildningen. Metoden presenteres i videoformat for å vise hvordan man bruker åpen vindustilnærming i mus for å undersøke strukturelle og funksjonelle endringer i cochlear mikrosirkulasjon under normale og patologiske forhold.

Etter kirurgisk eksponering av cochlea-kapillærene i sideveggen (figur 1) var intravital høyoppløselig fluorescensmikroskopisk observasjon av dilmerkede blodceller i FITC-dextran-merkede kar mulig gjennom et åpent fartøyvindu. Figur 2A er et representativt bilde tatt under FIVM som viser kapillærene til musecochlear apex-midtre sving sidevegg. Lumina av disse fartøyene er synliggjort av fluorescensen av FITC-dextran blande...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

En åpen fartøy-vindu tilnærming ved hjelp av fluorescerende tracers gir tilstrekkelig oppløsning for cochlear blodstrøm (CoBF) måling. Metoden letter studiet av strukturelle og funksjonelle endringer i CoBF i mus under normale og patologiske forhold.

Måling av strial blodstrøm i mus cochlea utnytte et åpent fartøy-vindu og intravital fluorescens mikroskopi

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Normal blodtilførsel til sneglehus er kritisk viktig for cochlea Ménières sykdom, spesielt for å opprettholde innendørs cochleapotensial, som er den essensielle drivkraften for transaksjoner av hårceller. Denne funksjonen av blodsirkulasjon har vært nært forbundet med ulike former for hørselstap. Bedre forståelse av cochlear blodstrøm vil muliggjøre mer effektiv behandling av hørselsforstyrrelser som følge av blodstrømsdysfunksjon.Imidlertid er direkte blodstrømsmåling svært utfordrende på grunn av vanskeligheter med å vurdere det indre øret. Teknikker for å vurdere cochlear blodstrøm er for tiden fortsatt under utvikling. Her demonstrerer vi en av de nyeste metodene som er etablert i vårt laboratorium, åpner muskelvindu i innkvartering med høyoppløselig fluorescensmikroskop for å begrense cochlear blodstrøm i små dyrearter som mus.Anvendelse av denne teknikken med transgenetiske massemodeller har potensial for å fremme forskning for å løse koblingene mellom hørselsfunksjon og patologi relatert til cochlear blodstrøm i intravaskulær risiko. Våre prosedyrer bør utføres med forsiktighet. I tillegg til kortvarig kroppsblødning, må dyrets vitale tegn, inkludert blodtrykk og hjerterytme, overvåkes under operasjonen.Begynn med å samle omtrent en millimeter blod i heparin ved hjertepunksjon. Sentrifuge blodet ved 3000 ganger G i tre minutter ved fire grader Celsius. Fjern plasmaet, vask deretter blodcellepelleten med en milliliter PBS tre ganger ved sentrifugering ved 3000 ganger G i tre minutter ved fire grader Celsius.Merk blodcellene med en milliliter 20 mikromolar DiO eller Dil i PBS, og inkuber i mørket i 30 minutter ved romtemperatur. Vask de merkede blodcellene med en milliliter PBS og sentrifuge tre ganger ved 3000 ganger G i tre minutter. Resuspend cellepelleten i 30% hematokrit med ca. 0,9 ml PBS før injeksjon.Forbered sterile kirurgiske instrumenter og bildebehandlingsplattform og plasser en varmepute under draperiet. Overvåk den dårlige refleksen og den generelle muskeltonen til de bedøvede musene for å kontrollere anestesiens dybde. Plasser dyret på den varme varmeputen og halen i overvåkingssystemet for overvåking av blodtrykk og hjerterytme.Oppretthold rektaltemperaturen ved 37 grader Celsius og registrer dyrets systoliske blodtrykk, diastolisk blodtrykk og gjennomsnittlig blodtrykk i bedøvelsestilstand. Åpne venstre tympanisk bulla via en lateral og vental tilnærming under et stereomikroskop og la trommehinnen og ossiklene være intakte. Lag et snitt langs midtlinjen av dyrets nakke med hodet immobilisert for å minimere bevegelse.Fjern venstre sub mandibulær kjertel og bakre mage av den digastriske muskelen og cauterize. Finn og utsett den benete bulla ved å identifisere sternocleidomastoid muskel og ansiktsnerve som strekker seg fremre mot bulla. Åpne benete bulla med en 30 gauge nål og fjern forsiktig det omkringliggende beinet med kirurgisk pinsett for å gi en klar utsikt over cochlear og stapedial arterie med sin mediale margin liggende over kanten av det runde vinduet nisje og forårsaker fremre overlegen mot det ovale vinduet.Bruk et lite knivblad til å skrape sideveggbenet ved toppen av den midterste svingen på musens sneglehus ca. 1,25 millimeter fra toppunktet til en tynn flekk er sprukket. Fjern beinflisene med små trådkroker. Dekk fartøyvinduet med en kuttet dekselslipp for å bevare normale fysiologiske forhold og gi en optisk visning for opptak av fartøybilder.Lag et en centimeter snitt langs høyre saphenous vene for å eksponere fartøyet. Tilfør suksessivt 100 mikroliter hver av FITC-Dextran-løsningen og blodcellesuspensjonen i dyret gjennom saphenøs vene for å muliggjøre visualisering av blodkarene og sporing av blodstrømmen. Observer blodstrømmen i sanntid på en videomonitor fem minutter etter injeksjonen.Avbilde blodkarene ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med et langt arbeidsavstandsmål og et lampehus som inneholder et eksitasjonsfilter med flere bånd og kompatibelt utslippsfilter. Ta opp videoen ved hjelp av et høyoppløselig digitalt svart-hvitt ladet koblet enhetskamera som får mer enn 350 bilder per video. For å sikre vellykket analyse av strømningshastigheten.Mål fartøyets diameter ved hjelp av passende programvare og bestem avstanden mellom to faste punkter over fartøyet i de oppkjøpte bildene. Åpne videoen av blodstrømmen i programvaren og angi omfanget av bildene. Spor de valgte DiO-fargede blodcellene ved hjelp av sporingsfunksjonen.Bruk deretter avstanden cellene har flyttet og tidsintervallet mellom bilderammer i videoen for automatisk beregning av strømningshastigheten. Beregn volumstrømmen ved hjelp av ligningen gitt i tekstmanuskriptet. For å lage støyeksponeringsmodellen før blodstrømopptak, plasser dyrene i nettingbur og utsett dem for bredbåndsstøy ved 120 desibel lydtrykknivå i en lydeksponeringsbod i tre timer.Deretter i ytterligere tre timer neste dag. Ta opp blodstrømmen to uker etter støyeksponering. Etter kirurgisk eksponering av cochlea-kapillærene i sideveggen, ble intravital høyoppløselig fluorescensmikroskopisk observasjon av DiL-merkede blodceller i FITC Dextran-merkede kar utført gjennom et åpent fartøyvindu.DiL-merkede blodceller i Stria-kar merket med FITC Dextran er vist her. Dio-merkede blodceller merket med FITC Dextran viser at fartøyets tetthet av spiralligamentet er sparsommere enn den tettere Stria vascularis. Høyoppløselig IVM viser blodstrømningsmønstrene i kontroll- og støyutsatte grupper.Det forstyrrede sirkulasjonsmønsteret kan ses i de støyeksponerte gruppene. Uregelmessigheter inkluderte redusert kardiameter og økt variasjon i kardiameter. Blodstrømningshastighetene i kontroll- og støyeksponerte grupper ble beregnet ved å spore røttene til de DiO-merkede blodcellene.Blodhastigheten og volumet i den støyeksponerte gruppen var signifikant lavere enn i kontrollgruppen. Vellykket etablering av det åpne fartøyvinduet krever en høy grad av kirurgisk ferdighet. Det må utvises forsiktighet ved fjerning av beinet i cochlear sideveggen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisering og analyse av Blood Flow og oksygenforbruk i Nedsatt mikrosirkulasjonen: Søknad til akutt hepatitt Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

En orthotopic Glioblastoma Mouse Model Opprettholde Brain Parenkymalt fysiske begrensninger og Egnet for Intravital To-foton mikroskopi

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Automatisert Måling av microcirculatory Blood Flow Velocity i lungemetastaser av Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Evaluering av Planar-Cell-polaritet fenotyper i Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Kombinert Intravital mikroskopi og kontrast forbedret Ultrasonography av mus-Hindlimb for å studere Insulin-indusert vasodilatasjon og muskel perfusjon

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Intramikroskopi og Trombevekten Induksjon i øreflippen av en naken Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

En kronisk hjertesvikt Ischemia modell i svin bruker en Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Samtidige Electrocardiography opptak og invasiv blod trykk måling i rotter

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Samtidige Flow analytiske karakterisering av flere celletyper Hentet fra mus Brain/ryggmarg gjennom ulike homogenisering metoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...