Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) e Medical Research Foundation da Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).

NOTA: Esta é uma cirurgia de não sobrevivência. Todos os procedimentos envolvendo o uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oregon Health & Science University (número de aprovação da IACUC: TR01_IP00000968).
1. Preparação das células sanguíneas rotuladas por fluorescentes
<ol><li>Anestesiar os camundongos doadores (camundongos C57BL/6J machos com idade ~6 semanas) com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de solução ane...

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+[corrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research.">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li><li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention.">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li><li>Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow.">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li><li>Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system.">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).</li><li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow.">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li><li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo.">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li><li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

Este artigo demonstra como os capilares na parede lateral coclear (e na estria vascularis) de um modelo de mouse podem ser visualizados com rotulagem fluorófora em uma preparação aberta de janela de vaso sob um sistema FIVM. O modelo de camundongos é amplamente utilizado e preferido como um modelo mamífero para investigar a saúde e a doença humana. O protocolo descrito aqui é uma abordagem viável para a imagem e investigação de CoBF na parede lateral do rato (particularmente na estria vascularis) usando uma ja...

A função normal da microcirculação na parede coclear lateral (compreendendo a maioria dos capilares no ligamento espiral e estria vascularis) é criticamente importante para a manutenção da função auditiva1. CoBF anormal está implicado na fisiopatologia de muitos distúrbios do ouvido interno, incluindo perda auditiva induzida por ruído, hidrops de ouvido e presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. A visualização do CoBF intravital permitirá uma melhor compreensão dos vínculos entre a função auditiva e a patologia vascular coclear.
Embora a complexidade e a localização da cóclea dentro do osso temporal impeça a visualização direta e a medição do CoBF, vários métodos foram desenvolvidos para a avaliação da CoBF, incluindo a estirmetria de fluxo de doppler a laser (LDF)10,11,12, ressonância magnética (RM)13, microscopia intravital fluorescência (FIVM)14, microendoscopia de fluorescência (FME)15, endoscópica de análise de contraste de ondas laser (LSCI)16 , e abordagens baseadas na injeção de marcadores rotulados e microesferas marcadas radioativamente na corrente sanguínea (microangiografia óptica, OMAG)17,18,19,20. No entanto, nenhum desses métodos permitiu o acompanhamento absoluto em tempo real das alterações no CoBF in vivo, com exceção da FIVM. FIVM, em combinação com uma janela de vaso na parede coclear lateral, é uma abordagem que tem sido usada e validada em cobaia em diferentes condições experimentais por vários laboratórios 14,21,22.
Um método FIVM foi estabelecido com sucesso para estudar as alterações estruturais e funcionais na microcirculação coclear no camundongo usando isothiocnato fluoresceína (FITC)-dextran como meio de contraste e um corante de fluorescência - ou DiO (3, 3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato, verde) ou Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-3-tetramethylindocarbocyanine perclorato, vermelho)-para pré-rotular glóbulos, visualizar vasos e rastrear a velocidade do fluxo sanguíneo. No presente estudo, o protocolo deste método foi descrito para imagens e alterações quantificantes no CoBF no camundongo em condições normais e patológicas (como após exposição ao ruído). Esta técnica dá ao pesquisador as ferramentas necessárias para investigar os mecanismos subjacentes do CoBF relacionados à disfunção auditiva e patologia na estria vascularis, especialmente quando aplicada em conjunto com modelos de camundongos transgênicos prontamente disponíveis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

A transdução do som é metabolicamente exigente, e a função normal da microvasculatura na parede lateral é fundamental para manter o potencial endococlear, o transporte de íons e o equilíbrio de fluidos. Diferentes formas de distúrbios auditivos envolvem microcirculação anormal na cóclea. A investigação de como a patologia do fluxo sanguíneo coclear (CoBF) afeta a função auditiva é desafiadora devido à falta de métodos de interrogatório viáveis e à dificuldade de acesso ao ouvido interno. Uma janela de vaso aberto na parede coclear lateral, combinada com microscopia intravital de fluorescência, tem sido usada para estudar mudanças de CoBF in vivo, mas principalmente em cobaia e apenas recentemente no mouse. Este papel e o vídeo associado descrevem o método aberto da janela do vaso para visualizar o fluxo sanguíneo na cóclea do rato. Os detalhes incluem 1) preparação da suspensão de células sanguíneas rotuladas por fluorescentes em camundongos; 2) construção de uma janela de vaso aberta para microscopia intravital em um rato anestesiado, e 3) medição da velocidade e volume do fluxo sanguíneo usando uma gravação offline da imagem. O método é apresentado em formato de vídeo para mostrar como usar a abordagem da janela aberta no mouse para investigar alterações estruturais e funcionais na microcirculação coclear em condições normais e patológicas.

Após a exposição cirúrgica dos capilares cocleares na parede lateral (Figura 1), a observação microscópica de fluorescência intravital de alta resolução das células sanguíneas rotuladas por Dil em vasos rotulados pelo FITC-dextran era viável através de uma janela de vaso aberto. Figura 2A é uma imagem representativa tirada sob FIVM que mostra os capilares da parede lateral do ápice coclear do mouse. A lumina deste...

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Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Uma abordagem aberta da janela do vaso usando rastreadores fluorescentes fornece resolução suficiente para a medição do fluxo sanguíneo coclear (CoBF). O método facilita o estudo de mudanças estruturais e funcionais no CoBF no camundongo em condições normais e patológicas.

Medição do fluxo sanguíneo strial em Cochlea de rato utilizando uma janela de vaso aberto e microscopia de fluorescência intravital

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

O fornecimento normal de sangue para cóclea é criticamente importante para a Doença de Cochlea Meniere, especialmente para a manutenção do potencial coclear interno, que é a força motriz essencial para a transação de células ciliares. Esta função de circulação sanguínea tem sido intimamente associada com diferentes formas de perda auditiva. Uma melhor compreensão do fluxo sanguíneo coclear permitirá um gerenciamento mais eficaz dos distúrbios auditivos resultantes da disfunção do fluxo sanguíneo.No entanto, a medição direta do fluxo sanguíneo é muito, muito desafiadora devido à dificuldade de avaliar o ouvido interno. Técnicas para avaliar o fluxo sanguíneo coclear ainda estão em desenvolvimento. Aqui demonstramos um dos métodos recentes estabelecidos em nosso laboratório abrir janela muscular em acomodação com microscópio de fluorescência de alta resolução para reduzir o fluxo sanguíneo coclear em pequenas espécies animais, como o rato.A aplicação dessa técnica com modelos de massa transgenética tem o potencial de avançar na pesquisa para desvendar as ligações entre a função auditiva e a patologia relacionada ao fluxo sanguíneo coclear em risco intravascular. Nossos procedimentos devem ser conduzidos com cautela. Além da hemorragia corporal momentânea, os sinais vitais do animal, incluindo pressão arterial e batimentos cardíacos, devem ser monitorados durante a cirurgia.Comece coletando aproximadamente um milímetro de sangue na heparina por punção cardíaca. Centrifugar o sangue a 3000 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius. Remova o plasma, depois lave a pelota de célula sanguínea com um mililitro de PBS três vezes por centrifugação a 3000 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius.Rotule as células sanguíneas com um mililitro de 20 dio micromolar ou dil em PBS, e incubar no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. Lave as células sanguíneas rotuladas com um mililitro de PBS e centrífuga três vezes a 3000 vezes G por três minutos. Resuspend a pelota celular em 30% hematócrito com aproximadamente 0,9 mililitros de PBS antes da injeção.Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis e plataforma de imagem e coloque uma almofada de aquecimento sob a cortina. Monitore o reflexo ruim e o tônus muscular geral dos camundongos anestesiados para verificar a profundidade da anestesia. Coloque o animal na almofada de aquecimento quente e sua cauda no sistema de monitor para monitorar a pressão arterial e os batimentos cardíacos.Mantenha a temperatura retal a 37 graus Celsius e regissou a pressão arterial sistólica do animal, pressão arterial diastólica e pressão arterial média na condição anestesiada. Abra a bula timpânica esquerda através de uma abordagem lateral e vental sob um microscópio estéreo deixando a membrana timpânica e ossículos intactas. Faça uma incisão ao longo da linha média do pescoço do animal com a cabeça imobilizada para minimizar o movimento.Remova a glândula sub mandibular esquerda e a barriga posterior do músculo digastric e cauterize. Localize e exponha a bula óssea identificando o músculo estenicleidomastoide e o nervo facial estendendo-se anteriormente em direção à bula. Abra a bula óssea com uma agulha de calibre 30 e remova cuidadosamente o osso circundante com pinças cirúrgicas para fornecer uma visão clara da artéria coclear e stapedial com sua margem medial sobre a borda do nicho da janela redonda e causando superior anterior em direção à janela oval.Use uma pequena lâmina de faca para raspar o osso da parede lateral na curva média do ápice da cóclea do rato aproximadamente 1,25 milímetros do ápice até que um ponto fino seja rachado. Remova os lascas de osso com pequenos ganchos de arame. Cubra a janela do vaso com um deslizamento de tampa de corte para preservar as condições fisiológicas normais e forneça uma visão óptica para a gravação de imagens do vaso.Faça uma incisão de um centímetro ao longo da veia safena direita para expor o vaso. Infundir sucessivamente 100 microliters cada uma das soluções FITC-Dextran e a suspensão das células sanguíneas no animal através da veia safena para permitir a visualização dos vasos sanguíneos e o rastreamento do fluxo sanguíneo. Observe o fluxo sanguíneo em tempo real em um monitor de vídeo cinco minutos após a injeção.Imagem dos vasos sanguíneos usando um microscópio de fluorescência equipado com um objetivo de longa distância de trabalho e uma caixa de lâmpada contendo um filtro de excitação de banda múltipla e filtro de emissão compatível. Grave o vídeo usando uma câmera de dispositivo digital de alta resolução em preto e branco, adquirindo mais de 350 imagens por vídeo. Para garantir uma análise bem sucedida da velocidade de fluxo.Meça o diâmetro da embarcação usando software apropriado e determine a distância entre dois pontos fixos através da embarcação nas imagens adquiridas. Abra o vídeo do fluxo sanguíneo no software e defina a escala das imagens. Rastreie as células sanguíneas manchadas de DiO selecionadas usando a função de rastreamento.Em seguida, use a distância que as células moveram e o intervalo de tempo entre os quadros de imagem no vídeo para o cálculo automático da velocidade de fluxo. Calcule o fluxo volutivo usando a equação dada no manuscrito do texto. Para criar o modelo de exposição ao ruído antes da gravação do fluxo sanguíneo, coloque os animais em gaiolas de malha de arame e exponha-os ao ruído de banda larga a 120 decibéis nível de pressão sonora em uma cabine de exposição sonora por três horas.Então, por mais três horas no dia seguinte. Registo sanguíneo duas semanas após exposição ao ruído. Após a exposição cirúrgica dos capilares cocleares na parede lateral, a observação microscópica de fluorescência intravital de alta resolução das células sanguíneas rotuladas por DiL nos vasos rotulados fitc Dextran foi realizada através de uma janela de vaso aberto.Células sanguíneas rotuladas por DiL em vasos stria rotulados com FITC Dextran são mostrados aqui. Células sanguíneas rotuladas com FITC Dextran mostram que a densidade do vaso do ligamento espiral é mais escassa que a da mais densa Stria vascularis. IVM de alta resolução mostra os padrões de fluxo sanguíneo em grupos controlados e expostos ao ruído.O padrão perturbado da circulação sanguínea pode ser visto nos grupos expostos ao ruído. As anomalias incluíram redução do diâmetro do vaso e aumento da variação do diâmetro do vaso. As velocidades de fluxo sanguíneo nos grupos de controle e ruído expostos foram calculadas através do rastreamento das raízes das células sanguíneas rotuladas pelo DiO.A velocidade sanguínea e o volume no grupo exposto ao ruído foram significativamente menores do que no grupo controle. O estabelecimento bem sucedido da janela do vaso aberto requer um alto grau de habilidade cirúrgica. Deve-se ter cuidado na remoção do osso da parede lateral coclear.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Medicina

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Automated Medição da microcirculação sanguínea velocidade na Pulmonar Metástases of Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Combinado de microscopia Intravital e ultra-sonografia contraste aprimorado do membro posterior Mouse para estudar a vasodilatação induzida por insulina e perfusão muscular

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Intravital Microscopia e trombo Indução no lóbulo da orelha de um rato calvo

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Um modelo de isquemia cardíaca crônica em suínos, usando um Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Gravação simultânea de eletrocardiografia e sangue invasiva pressão medida em ratos

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Caracterização citométrica de fluxo simultâneo de múltiplos tipos de células recuperadas do cérebro do camundongo/medula espinhal através de diferentes métodos de homogeneização

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...