Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Это исследование было поддержано NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) и Фондом медицинских исследований из Орегонского университета здоровья и науки (OHSU) (X.Shi).

ПРИМЕЧАНИЕ: Это операция, не связанная с выживанием. Все процедуры, связанные с использованием животных, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Орегонском университете здравоохранения и науки (номер одобрения IACUC: TR01_IP00000968)....

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+[corrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research.">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li><li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention.">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li><li>Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow.">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li><li>Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders.">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).</li><li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants.">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li><li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser+Doppler:+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow.">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li><li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI.">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li><li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system.">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).</li><li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow.">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li><li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo.">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li><li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

В данной работе показано, как капилляры в кохлеарной боковой стенке (и в stria vascularis) мышиной модели могут быть визуализированы с помощью флуорофорной маркировки в препарате с открытым сосудом-окном в системе FIVM. Мышиная модель широко используется и предпочтительна в качестве модели млек...

Нормальная функция микроциркуляции в боковой кохлеарной стенке (включающей большинство капилляров в спиральной связке и stria vascularis) критически важна для поддержания слуховой функции1. Аномальный CoBF участвует в патофизиологии многих заболеваний внутреннего уха, включая потерю слуха, вызванную шумом, ушную водянку и пресбикусис 2,3,4,5,6,7,8,9. Визуализация прижизненного CoBF позволит лучше понять связи между функцией слуха и кохлеарной сосудистой патологией.
Хотя сложность и расположение улитки в височной кости исключает прямую визуализацию и измерение CoBF, для оценки CoBF были разработаны различные методы, включая лазерно-допплеровскую флоуметрию (LDF)10,11,12, магнитно-резонансную томографию (МРТ)13, флуоресцентную прижизненную микроскопию (FIVM)14, флуоресцентную микроэндоскопию (FME)15, эндоскопическую лазерную спекл-контрастную визуализацию (LSCI)16 , и подходы, основанные на введении меченых маркеров и радиоактивно меченых микросфер в кровоток (оптическая микроангиография, OMAG)17,18,19,20. Однако ни один из этих методов не позволяет в режиме реального времени отслеживать изменения в CoBF in vivo, за исключением FIVM. FIVM, в сочетании с сосудом-окном в боковой кохлеарной стенке, является подходом, который был использован и проверен на морской свинке в различных экспериментальных условиях различными лабораториями 14,21,22.
Был успешно разработан метод FIVM для изучения структурно-функциональных изменений кохлеарной микроциркуляции у мышей с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-декстрана в качестве контрастного вещества и флуоресцентного красителя - либо DiO (3, 3'-диоктацилоксакарбоцианин перхлорат, зеленый) или Dil (1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндокарбоциан перхлорат, красный) - для предварительной маркировки клеток крови, визуализации сосудов и отслеживания скорости кровотока. В настоящем исследовании протокол этого метода был описан для визуализации и количественной оценки изменений CoBF у мышей при нормальных и патологических состояниях (например, после воздействия шума). Этот метод дает исследователю инструменты, необходимые для изучения основных механизмов CoBF, связанных с дисфункцией слуха и патологией в стриях васкулярных мышц, особенно при применении в сочетании с легкодоступными трансгенными моделями мышей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

Трансдукция звука метаболически требовательна, и нормальная функция микроциркуляторного русла в боковой стенке имеет решающее значение для поддержания эндокохлеарного потенциала, транспорта ионов и баланса жидкости. Сообщается, что различные формы нарушений слуха связаны с аномальной микроциркуляцией в улитке. Исследование того, как патология кохлеарного кровотока (CoBF) влияет на функцию слуха, является сложной задачей из-за отсутствия осуществимых методов опроса и трудностей с доступом к внутреннему уху. Открытое сосудистое окно в боковой кохлеарной стенке в сочетании с флуоресцентной прижизненной микроскопией использовалось для изучения изменений CoBF in vivo, но в основном у морских свинок и только недавно у мыши. В этой статье и связанном с ней видео описывается метод визуализации кровотока в улитке мыши. Детали включают 1) приготовление флуоресцентно меченой суспензии клеток крови от мышей; 2) строительство открытого сосуда-окна для прижизненной микроскопии у анестезируемой мыши и 3) измерение скорости и объема кровотока с помощью автономной записи изображения. Метод представлен в видеоформате, чтобы показать, как использовать подход с открытым окном у мышей для исследования структурных и функциональных изменений в кохлеарной микроциркуляции в нормальных и патологических условиях.

После хирургического воздействия кохлеарных капилляров в боковой стенке (рисунок 1) прижизненное флуоресцентное микроскопическое наблюдение за dil-мечеными клетками крови в меченых FITC-декстраном сосудах было возможно через открытое сосудистое окно. <s...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Подход с открытым окном сосудов с использованием флуоресцентных индикаторов обеспечивает достаточное разрешение для измерения кохлеарного кровотока (CoBF). Метод облегчает изучение структурно-функциональных изменений CoBF у мышей при нормальных и патологических состояниях.

Измерение стойлового кровотока у улитки мыши с использованием открытого сосудистого окна и прижизненной флуоресцентной микроскопии

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Нормальное кровоснабжение улитки критически важно для болезни улитки Меньера, особенно для поддержания кохлеарного потенциала в помещении, который является важной движущей силой для транзакции волосковых клеток. Эта функция кровообращения была тесно связана с различными формами потери слуха. Лучшее понимание кохлеарного кровотока позволит более эффективно управлять нарушениями слуха, вызванными дисфункцией кровотока.Тем не менее, прямое измерение кровотока очень сложно из-за сложности оценки внутреннего уха. Методы оценки кохлеарного кровотока в настоящее время все еще находятся в стадии разработки. Здесь мы демонстрируем один из последних методов, установленных в нашей лаборатории, открытое мышечное окно в аккомодации с флуоресцентным микроскопом высокого разрешения для сужения кохлеарного кровотока у мелких видов животных, таких как мыши.Применение этого метода с трансгенетическими моделями массы имеет потенциал для продвижения исследований по разгадке связей между функцией слуха и патологией, связанной с кохлеарным кровотоком во внутрисосудистом риске. Наши процедуры следует проводить с осторожностью. В дополнение к кратковременному кровоизлиянию в тело, жизненно важные показатели животного, включая кровяное давление и сердцебиение, должны контролироваться во время операции.Начните со сбора примерно одного миллиметра крови в гепарине путем пункции сердца. Центрифугируйте кровь в 3000 раз G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Извлекают плазму, затем промывают гранулу клеток крови одним миллилитром PBS три раза центрифугированием в 3000 раз G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.Маркируйте клетки крови одним миллилитром 20 микромоляров DiO или Dil в PBS и инкубируйте в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре. Промыть меченые клетки крови одним миллилитром PBS и трижды центрифугировать по 3000 раз G в течение трех минут. Перед инъекцией повторно суспендируют клеточную гранулу в 30% гематокрите с примерно 0,9 миллилитрами PBS.Подготовьте стерильные хирургические инструменты и платформу для визуализации и поместите грелку под драпировку. Следите за плохим рефлекторным и общим мышечным тонусом обезболенных мышей, чтобы проверить глубину анестезии. Поместите животное на теплую грелку и его хвост в систему мониторинга для контроля артериального давления и сердцебиения.Поддерживайте ректальную температуру на уровне 37 градусов цельсия и регистрируйте систолическое артериальное давление животного, диастолическое артериальное давление и среднее артериальное давление в анестезированном состоянии. Откройте левую барабанную перепонку с помощью бокового и вентиляционного подхода под стереомикроскопом, оставив барабанную перепонку и косточки нетронутыми. Сделайте разрез вдоль средней линии шеи животного с обездвиженной головой, чтобы свести к минимуму движение.Удалить левую подчелюстную железу и задний брюхо дигастральной мышцы и прижечь. Найдите и обнажите костную буллу, идентифицируя грудино-ключично-сосцевидную мышцу и лицевой нерв, простирающийся спереди к булле. Откройте костную буллу иглой 30 калибра и аккуратно удалите окружающую кость хирургическим пинцетом, чтобы обеспечить четкое представление о кохлеарной и стапедиальной артерии с ее медиальным краем, лежащим над краем круглой оконной ниши и вызывающим переднее верхнее к овальному окну.Используйте небольшое лезвие ножа, чтобы соскоблить кость боковой стенки на вершинном среднем повороте улитки мыши примерно в 1,25 миллиметрах от вершины, пока не треснет тонкое пятно. Удалите костные сколы небольшими проволочными крючками. Накройте окно сосуда вырезанным крышкой, чтобы сохранить нормальные физиологические условия и обеспечить оптический вид для записи изображений сосуда.Сделайте сантиметровый разрез вдоль правой подкожной вены, чтобы обнажить сосуд. Последовательно вливайте 100 микролитров каждого раствора FITC-Декстрана и суспензии клеток крови в животное через подкожную вену, чтобы обеспечить визуализацию кровеносных сосудов и отслеживание кровотока. Наблюдайте за кровотоком в режиме реального времени на видеомониторе через пять минут после инъекции.Визуализируйте кровеносные сосуды с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом на большом рабочем расстоянии и корпусом лампы, содержащим многополосный фильтр возбуждения и совместимый эмиссионный фильтр. Записывайте видео с помощью цифровой черно-белой камеры с зарядовой связью высокого разрешения, получая более 350 изображений на видео. Обеспечить успешный анализ скорости потока.Измерьте диаметр сосуда с помощью соответствующего программного обеспечения и определите расстояние между двумя фиксированными точками по всему сосуду на полученных изображениях. Откройте видео кровотока в программном обеспечении и установите масштаб изображений. Отслеживайте выбранные DiO окрашенные клетки крови с помощью функции отслеживания.Затем используйте расстояние, на которое переместились ячейки, и интервал времени между кадрами изображения в видео для автоматического расчета скорости потока. Рассчитайте объемный поток, используя уравнение, приведенное в тексте рукописи. Чтобы создать модель воздействия шума перед записью кровотока, поместите животных в клетки из проволочной сетки и подвергните их широкополосному шуму при уровне звукового давления 120 децибел в кабине для звуковой экспозиции в течение трех часов.Затем еще на три часа на следующий день. Записывайте кровоток через две недели после воздействия шума. После хирургического воздействия кохлеарных капилляров в боковой стенке через открытое окно сосудов проводилось прижизненное флуоресцентное микроскопическое наблюдение за мечеными DiL клетками крови в сосудах, меченных FITC Dextran.Меченые DiL клетки крови в сосудах Stria, помеченные FITC Dextran, показаны здесь. Меченые Dio клетки крови, помеченные FITC Dextran, показывают, что плотность сосудов спиральной связки более разрежена, чем у более плотной Stria vascularis. IVM с высоким разрешением показывает паттерны кровотока в контрольных и шумовых группах.Нарушенный рисунок кровообращения можно увидеть в группах, подвергшихся воздействию шума. Аномалии включали уменьшение диаметра сосуда и увеличение вариаций диаметра сосуда. Скорости кровотока в контрольной и шумовой группах были рассчитаны путем отслеживания корней меченых DiO клеток крови.Скорость и объем крови в группе, подвергшейся воздействию шума, были значительно ниже, чем в контрольной группе. Успешное установление открытого сосудистого окна требует высокой степени хирургического мастерства. Необходимо проявлять осторожность при удалении кости кохлеарной боковой стенки.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Визуализация и анализ потока крови и потребления кислорода в печеночной микроциркуляции: применение к модели острого гепатита

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Ортотопическая Глиобластома мышь Модель Поддержание Мозг паренхимы физических ограничений и подходит для прижизненной Двухфотонное микроскопии

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Автоматическое измерение микроциркуляции крови скорость потока в легочных метастазов у ​​крыс

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Оценка Planar-Cell-полярности фенотипов в цилиопатии Mouse Mutant улитки

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Комбинированный прижизненной микроскопии и повысить контрастность УЗИ задних конечностей мыши для изучения инсулин индуцированной вазодилатацию и мышечная перфузия

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Прижизненные микроскопии и Тромб индукция в мочке из безволосой мыши

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Хроническая сердечная ишемия модель в свиней, с помощью Ameroid удав

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Запись одновременно электрокардиография и инвазивных крови давления измерения в крыс

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Одновременное циклометрическое использование потока нескольких типов клеток, извлеченных из мозга мыши / спинного мозга с помощью различных методов гомогенизации

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...