Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) y Medical Research Foundation de Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).

NOTA: Esta es una cirugía de no supervivencia. Todos los procedimientos que involucran el uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón (número de aprobación de IACUC: TR01_IP00000968).
1. Preparación de las células sanguíneas marcadas con fluorescencia
<ol><li>Anestesiar a los ratones donantes (ratones machos C57BL/6J de edad ~6 semanas) con una inyección intraperitoneal (i.p.) de...

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+[corrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research.">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li><li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention.">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li><li>Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow.">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li><li>Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system.">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).</li><li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow.">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li><li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

Este documento demuestra cómo los capilares en la pared lateral coclear (y en la estría vascular) de un modelo de ratón se pueden visualizar con etiquetado fluoróforo en una preparación de ventana de vaso abierto bajo un sistema FIVM. El modelo de ratón es ampliamente utilizado y preferido como modelo de mamífero para investigar la salud humana y la enfermedad. El protocolo descrito aquí es un enfoque factible para obtener imágenes e investigar CoBF en la pared lateral del ratón (particularmente en la estría v...

La función normal de la microcirculación en la pared coclear lateral (que comprende la mayoría de los capilares en el ligamento espiral y la estría vascular) es de importancia crítica para mantener la función auditiva1. La CoBF anormal está implicada en la fisiopatología de muchos trastornos del oído interno, incluida la pérdida de audición inducida por ruido, la hidropesía del oído y la presbiacusia 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualización del CoBF intravital permitirá una mejor comprensión de los vínculos entre la función auditiva y la patología vascular coclear.
Aunque la complejidad y localización de la cóclea dentro del hueso temporal impide la visualización directa y la medición del CoBF, se han desarrollado diversos métodos para la evaluación del CoBF, incluyendo la flujometría láser-doppler (LDF)10,11,12, la resonancia magnética (RM)13, la microscopía intravital de fluorescencia (FIVM)14, la microendoscopia fluorescente (FME)15, la imagen endoscópica de contraste con moteado láser (LSCI)16 , y enfoques basados en la inyección de marcadores marcados y microesferas marcadas radiactivamente en el torrente sanguíneo (microangiografía óptica, OMAG)17,18,19,20. Sin embargo, ninguno de estos métodos ha permitido el seguimiento absoluto en tiempo real de los cambios en CoBF in vivo, con la excepción de FIVM. La FIVM, en combinación con una ventana de vaso en la pared coclear lateral, es un abordaje que ha sido utilizado y validado en cuyes bajo diferentes condiciones experimentales por diversos laboratorios 14,21,22.
Se estableció con éxito un método FIVM para estudiar los cambios estructurales y funcionales en la microcirculación coclear en ratón utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano como medio de contraste y un colorante de fluorescencia, ya sea DiO (perclorato de 3, 3′-dioctadeciloxacarbocianina, verde) o Dil (perclorato de 1,1-dioctadecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina, rojo), para premarcar las células sanguíneas, visualizar los vasos y rastrear la velocidad del flujo sanguíneo. En el presente estudio, se ha descrito el protocolo de este método para obtener imágenes y cuantificar los cambios en CoBF en ratones en condiciones normales y patológicas (como después de la exposición al ruido). Esta técnica proporciona al investigador las herramientas necesarias para investigar los mecanismos subyacentes de CoBF relacionados con la disfunción auditiva y la patología en la estría vascular, especialmente cuando se aplica junto con modelos de ratones transgénicos fácilmente disponibles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

La transducción del sonido es metabólicamente exigente, y la función normal de la microvasculatura en la pared lateral es crítica para mantener el potencial endococlear, el transporte de iones y el equilibrio de líquidos. Se informa que diferentes formas de trastornos auditivos implican microcirculación anormal en la cóclea. La investigación de cómo la patología del flujo sanguíneo coclear (CoBF) afecta la función auditiva es un desafío debido a la falta de métodos de interrogatorio factibles y la dificultad para acceder al oído interno. Una ventana de vaso abierta en la pared coclear lateral, combinada con microscopía intravital de fluorescencia, se ha utilizado para estudiar los cambios de CoBF in vivo, pero principalmente en conejillos de indias y solo recientemente en el ratón. Este documento y el video asociado describen el método de ventana de vaso abierto para visualizar el flujo sanguíneo en la cóclea del ratón. Los detalles incluyen 1) preparación de la suspensión de células sanguíneas marcadas con fluorescencia de ratones; 2) construcción de una ventana de vaso abierta para microscopía intravital en un ratón anestesiado, y 3) medición de la velocidad y el volumen del flujo sanguíneo utilizando una grabación fuera de línea de las imágenes. El método se presenta en formato de video para mostrar cómo usar el enfoque de ventana abierta en el ratón para investigar cambios estructurales y funcionales en la microcirculación coclear en condiciones normales y patológicas.

Después de la exposición quirúrgica de los capilares cocleares en la pared lateral (Figura 1), la observación microscópica de fluorescencia intravital de alta resolución de células sanguíneas marcadas con Dil en vasos marcados con FITC-dextrano fue factible a través de una ventana de vaso abierta. La Figura 2A es una imagen representativa tomada bajo FIVM que muestra los capilares de la pared lateral del ápice coclear d...

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Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Un enfoque de ventana de vaso abierto utilizando trazadores fluorescentes proporciona una resolución suficiente para la medición del flujo sanguíneo coclear (CoBF). El método facilita el estudio de los cambios estructurales y funcionales en CoBF en ratón en condiciones normales y patológicas.

Medición del flujo sanguíneo auricular en cóclea de ratón utilizando una ventana de vaso abierto y microscopía de fluorescencia intravital

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

El suministro normal de sangre a la cóclea es de vital importancia para la enfermedad de Meniere de la cóclea, especialmente para mantener el potencial coclear en interiores, que es la fuerza impulsora esencial para la transacción de células ciliadas. Esta función de la circulación sanguínea se ha asociado estrechamente con diferentes formas de pérdida auditiva. Una mejor comprensión del flujo sanguíneo coclear permitirá un manejo más eficaz de los trastornos auditivos resultantes de la disfunción del flujo sanguíneo.Sin embargo, la medición directa del flujo sanguíneo es muy, muy difícil debido a la dificultad para evaluar el oído interno. Las técnicas para evaluar el flujo sanguíneo coclear aún están en desarrollo. Aquí demostramos uno de los métodos recientes establecidos en nuestro laboratorio de ventana muscular abierta en alojamiento con microscopio de fluorescencia de alta resolución para estrechar el flujo sanguíneo coclear en especies de animales pequeños como el ratón.La aplicación de esta técnica con modelos de masa transgenética tiene el potencial de avanzar en la investigación para desentrañar los vínculos entre la función auditiva y la patología relacionada con el flujo sanguíneo coclear en el riesgo intravascular. Nuestros procedimientos deben llevarse a cabo con precaución. Además de la hemorragia corporal momentánea, los signos vitales del animal, incluida la presión arterial y los latidos del corazón, deben controlarse durante la cirugía.Comience recolectando aproximadamente un milímetro de sangre en heparina mediante punción cardíaca. Centrifugar la sangre a 3000 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Retire el plasma, luego lave el pellet de células sanguíneas con un mililitro de PBS tres veces por centrifugación a 3000 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.Etiquete las células sanguíneas con un mililitro de 20 micromolares DiO o Dil en PBS, e incubar en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave las células sanguíneas marcadas con un mililitro de PBS y centrifugar tres veces a 3000 veces G durante tres minutos. Resuspender el pellet celular en hematocrito al 30% con aproximadamente 0,9 mililitros de PBS antes de la inyección.Prepare instrumentos quirúrgicos estériles y una plataforma de imágenes y coloque una almohadilla térmica debajo de la cortina. Monitoree el reflejo deficiente y el tono muscular general de los ratones anestesiados para verificar la profundidad de la anestesia. Coloque al animal en la almohadilla térmica caliente y su cola en el sistema de monitoreo para controlar la presión arterial y los latidos del corazón.Mantenga la temperatura rectal a 37 grados centígrados y registre la presión arterial sistólica del animal, la presión arterial diastólica y la presión arterial media en la condición anestesiada. Abra la bulla timpánica izquierda a través de un enfoque lateral y vental bajo un microscopio estereoscópico dejando intactos la membrana timpánica y los osículos. Haga una incisión a lo largo de la línea media del cuello del animal con la cabeza inmovilizada para minimizar el movimiento.Extirpar la glándula submandibular izquierda y el vientre posterior del músculo digástrico y cauterizar. Localice y exponga la bulla ósea identificando el músculo esternocleidomastoideo y el nervio facial que se extiende anteriormente hacia la bulla. Abra la bulla ósea con una aguja de calibre 30 y retire cuidadosamente el hueso circundante con pinzas quirúrgicas para proporcionar una visión clara de la arteria coclear y estapedial con su margen medial sobre el borde del nicho de la ventana redonda y causando la parte superior anterior hacia la ventana oval.Use una hoja de cuchillo pequeña para raspar el hueso de la pared lateral en el ápice del medio giro de la cóclea del ratón aproximadamente a 1,25 milímetros del ápice hasta que se agriete un punto delgado. Retire las astillas de hueso con pequeños ganchos de alambre. Cubra la ventana del recipiente con un cubreobjetos cortado para preservar las condiciones fisiológicas normales y proporcione una vista óptica para grabar imágenes del recipiente.Haga una incisión de un centímetro a lo largo de la vena safena derecha para exponer el vaso. Infundir sucesivamente 100 microlitros de cada una de la solución FITC-Dextrano y la suspensión de células sanguíneas en el animal a través de la vena safena para permitir la visualización de los vasos sanguíneos y el seguimiento del flujo sanguíneo. Observe el flujo sanguíneo en tiempo real en un monitor de video cinco minutos después de la inyección.Imagen de los vasos sanguíneos utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de larga distancia de trabajo y una carcasa de lámpara que contiene un filtro de excitación de banda múltiple y un filtro de emisión compatible. Grabe el video utilizando una cámara de dispositivo de carga acoplada en blanco y negro digital de alta resolución que adquiere más de 350 imágenes por video. Asegurar un análisis exitoso de la velocidad del flujo.Mida el diámetro del recipiente utilizando el software apropiado y determine la distancia entre dos puntos fijos a través del recipiente en las imágenes adquiridas. Abra el video del flujo sanguíneo en el software y configure la escala de las imágenes. Rastree las células sanguíneas teñidas con DiO seleccionadas utilizando la función de seguimiento.A continuación, utilice la distancia a la que se han movido las celdas y el intervalo de tiempo entre fotogramas de imagen en el vídeo para el cálculo automático de la velocidad de flujo. Calcule el flujo volumétrico utilizando la ecuación dada en el manuscrito de texto. Para crear el modelo de exposición al ruido antes de registrar el flujo sanguíneo, coloque a los animales en jaulas de malla de alambre y exponerlos a ruido de banda ancha a un nivel de presión sonora de 120 decibelios en una cabina de exposición al sonido durante tres horas.Luego, durante tres horas adicionales al día siguiente. Registre el flujo sanguíneo dos semanas después de la exposición al ruido. Después de la exposición quirúrgica de los capilares cocleares en la pared lateral, la observación microscópica de fluorescencia intravital de alta resolución de las células sanguíneas marcadas con DiL en los vasos marcados con Dextrano FITC se realizó a través de una ventana de vaso abierta.Aquí se muestran las células sanguíneas marcadas con DiL en los vasos Stria marcados con FITC Dextran. Las células sanguíneas marcadas con FITC Dextrano muestran que la densidad de los vasos del ligamento espiral es más escasa que la de la Stria vascularis más densa. La MIV de alta resolución muestra los patrones de flujo sanguíneo en los grupos de control y expuestos al ruido.El patrón alterado de la circulación sanguínea se puede ver en los grupos expuestos al ruido. Las anomalías incluyeron reducción del diámetro del vaso y aumento de la variación en el diámetro del vaso. Las velocidades de flujo sanguíneo en los grupos de control y exposición al ruido se calcularon mediante el seguimiento de las raíces de las células sanguíneas marcadas con DiO.La velocidad y el volumen de la sangre en el grupo expuesto al ruido fueron significativamente más bajos que en el grupo de control. El establecimiento exitoso de la ventana de vaso abierto requiere un alto grado de habilidad quirúrgica. Se debe tener cuidado al extirpar el hueso de la pared lateral coclear.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualización y análisis de flujo de la sangre y del consumo de oxígeno en la microcirculación hepática: Aplicación a un Modelo de cuadro de hepatitis aguda

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Investigación

Medicina

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Medición Automatizada de la microcirculación de la sangre Velocidad del caudal en metástasis pulmonar de ratas

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Combina la microscopia Intravital y ecografía de contraste de la trasera de ratón para estudiar la perfusión muscular y vasodilatación inducida por la insulina

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Microscopia intravital y trombos de inducción en el lóbulo de la oreja de un ratón sin pelo

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Un modelo de isquemia cardíaca crónica en cerdos usando un Constrictor Ameroid

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Grabación simultánea de electrocardiografía y sangre invasiva presión medida en ratas

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Caracterización citométrica de flujo simultáneo de múltiples tipos de células recuperadas del cerebro del ratón/cordón espinal a través de diferentes métodos de homogeneización

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...