Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Denna forskning stöddes av NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) och Medical Research Foundation från Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).

OBS: Detta är en icke-överlevnadsoperation. Alla förfaranden som involverar användning av djur granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Oregon Health & Science University (IACUC godkännandenummer: TR01_IP00000968).
1. Beredning av de fluorescerande märkta blodkropparna
<ol><li>Bedöva donatormössen (manliga C57BL/6J-möss i åldern ~6 veckor) med en intraperitoneal (i.p.) injektion av ketamin/xylazinlösning (5 ml/kg, se materialförteckning...

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+[corrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research.">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li><li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention.">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li><li>Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow.">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li><li>Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders.">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).</li><li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants.">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li><li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser+Doppler:+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow.">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li><li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI.">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li><li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system.">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).</li><li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow.">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li><li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo.">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li><li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

Denna uppsats visar hur kapillärer i den cochleära sidoväggen (och i stria vascularis) i en musmodell kan visualiseras med fluoroformärkning i ett öppet kärlfönsterberedning under ett FIVM-system. Musmodell används ofta och föredras som en däggdjursmodell för att undersöka människors hälsa och sjukdom. Protokollet som beskrivs här är ett genomförbart tillvägagångssätt för avbildning och undersökning av CoBF i musens sidovägg (särskilt i stria vascularis) med hjälp av ett öppet kärlfönster unde...

Mikrocirkulationens normala funktion i den laterala cochleaväggen (som omfattar majoriteten av kapillärerna i spiralbandet och stria vascularis) är kritiskt viktigt för att upprätthålla hörselfunktionen1. Onormal CoBF är inblandad i patofysiologin hos många inre öronsjukdomar inklusive bullerinducerad hörselnedsättning, öronhydrops och presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisering av intravital CoBF kommer att möjliggöra en bättre förståelse av kopplingarna mellan hörselfunktion och cochleär vaskulär patologi.
Även om komplexiteten och placeringen av snäckan i det temporala benet utesluter direkt visualisering och mätning av CoBF, har olika metoder utvecklats för bedömning av CoBF inklusive laser-dopplerflödesmetri (LDF)10,11,12, magnetisk resonanstomografi (MRI)13, fluorescens intravital mikroskopi (FIVM)14, fluorescensmikroskopi (FME)15, endoskopisk laserspektledkontrastavbildning (LSCI)16 och metoder baserade på injektion av märkta markörer och radioaktivt märkta mikrosfärer i blodomloppet (optisk mikroangografi, OMAG)17,18,19,20. Ingen av dessa metoder har dock möjliggjort absolut realtidsspårning av förändringar i CoBF in vivo, med undantag för FIVM. FIVM, i kombination med ett kärlfönster i den laterala cochleaväggen, är ett tillvägagångssätt som har använts och validerats hos marsvin under olika experimentella förhållanden av olika laboratorier 14,21,22.
En FIVM-metod etablerades framgångsrikt för att studera de strukturella och funktionella förändringarna i den cochleära mikrocirkulationen hos mus med hjälp av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-dextran som kontrastmedium och fluorescensfärgämne - antingen DiO (3, 3′-dioctadecyloxacarbocyaninperklorat, grönt) eller Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetrametylindokarbocyaninperklorat, rött)-för förmärkning av blodkroppar, visualisering av kärl och spårning av blodflödeshastighet. I denna studie har protokollet för denna metod beskrivits för avbildning och kvantifiering av förändringar i CoBF hos mus under normala och patologiska förhållanden (t.ex. efter bullerexponering). Denna teknik ger forskaren de verktyg som behövs för att undersöka de underliggande mekanismerna för CoBF relaterade till hörseldysfunktion och patologi i stria vascularis, särskilt när de appliceras tillsammans med lättillgängliga transgena musmodeller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

Transduktion av ljud är metaboliskt krävande, och mikrovaskulaturens normala funktion i sidoväggen är avgörande för att upprätthålla endokochleär potential, jontransport och vätskebalans. Olika former av hörselskador rapporteras involvera onormal mikrocirkulation i snäckan. Undersökning av hur cochleärt blodflöde (CoBF) patologi påverkar hörselfunktionen är utmanande på grund av bristen på genomförbara förhörsmetoder och svårigheten att komma åt innerörat. Ett öppet kärlfönster i den laterala cochleaväggen, i kombination med fluorescens intravital mikroskopi, har använts för att studera CoBF-förändringar in vivo, men mestadels hos marsvin och först nyligen i musen. Detta papper och tillhörande video beskriver den öppna kärl-fönstermetoden för att visualisera blodflödet i mussnäckan. Detaljer inkluderar 1) beredning av den fluorescerande märkta blodcellssuspensionen från möss; 2) konstruktion av ett öppet kärlfönster för intravital mikroskopi i en bedövad mus, och 3) mätning av blodflödeshastighet och volym med hjälp av en offline-inspelning av avbildningen. Metoden presenteras i videoformat för att visa hur man kan använda öppna fönstermetoden i mus för att undersöka strukturella och funktionella förändringar i den cochleära mikrocirkulationen under normala och patologiska förhållanden.

Efter kirurgisk exponering av de cochleära kapillärerna i sidoväggen (figur 1) var intravital högupplöst fluorescensmikroskopisk observation av Dil-märkta blodkroppar i FITC-dextran-märkta kärl möjlig genom ett öppet kärlfönster. Figur 2A är en representativ bild tagen under FIVM som visar kapillärerna i musens cochleära apex-mittvrid sidovägg. Lumina av dessa kärl synliggörs av fluorescensen av FITC-dextran bla...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

En öppen kärlfönstermetod med fluorescerande spårämnen ger tillräcklig upplösning för mätning av cochleärt blodflöde (CoBF). Metoden underlättar studien av strukturella och funktionella förändringar i CoBF i mus under normala och patologiska förhållanden.

Mätning av steget blodflöde i mussnäcka med hjälp av ett öppet kärlfönster och intravital fluorescensmikroskopi

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Normal blodtillförsel till cochlea är av avgörande betydelse för cochlea Ménières sjukdom, särskilt för att upprätthålla cochleär potential inomhus, vilket är den viktigaste drivkraften för hårcellstransaktioner. Denna funktion av blodcirkulationen har varit nära associerad med olika former av hörselnedsättning. Bättre förståelse för cochleärt blodflöde kommer att möjliggöra effektivare hantering av hörselskador till följd av blodflödesdysfunktion.Direkt blodflödesmätning är dock mycket mycket utmanande på grund av svårigheter att bedöma innerörat. Tekniker för att bedöma cochleärt blodflöde är för närvarande fortfarande under utveckling. Här demonstrerar vi en av de senaste metoderna som etablerats i vårt labb öppna muskelfönster i boende med högupplöst fluorescensmikroskop för att begränsa cochleärt blodflöde hos små djurarter som mus.Tillämpning av denna teknik med transgenetiska massmodeller har potential att främja forskning för att reda ut kopplingarna mellan hörselfunktion och patologin relaterad till cochleärt blodflöde i intravaskulär risk. Våra rutiner bör genomföras med försiktighet. Förutom tillfällig kroppsblödning måste djurets vitala tecken, inklusive blodtryck och hjärtslag, övervakas under din operation.Börja med att samla ungefär en millimeter blod i heparin vid hjärtpunktion. Centrifugera blodet vid 3000 gånger G i tre minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort plasman och tvätta sedan blodcellpelleten med en milliliter PBS tre gånger genom centrifugering vid 3000 gånger G i tre minuter vid fyra grader Celsius.Märk blodkropparna med en milliliter 20 mikromolar DiO eller Dil i PBS och inkubera i mörkret i 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta de märkta blodkropparna med en milliliter PBS och centrifugera tre gånger vid 3000 gånger G i tre minuter. Återsuspendera cellpelleten i 30% hematokrit med cirka 0,9 ml PBS före injektion.Förbered sterila kirurgiska instrument och bildplattform och placera en värmedyna under draperiet. Övervaka den dåliga reflexen och den allmänna muskeltonen hos de bedövade mössen för att kontrollera anestesiens djup. Placera djuret på den varma värmedynan och svansen i monitorsystemet för övervakning av blodtryck och hjärtslag.Håll rektaltemperaturen vid 37 grader Celsius och registrera djurets systoliska blodtryck, diastoliska blodtryck och medelblodtryck i bedövat tillstånd. Öppna den vänstra tympaniska bullan via en lateral och vental inflygning under ett stereomikroskop och lämna det tympaniska membranet och ossiklarna intakta. Gör ett snitt längs mittlinjen i djurets nacke med huvudet immobiliserat för att minimera rörelsen.Ta bort den vänstra submandibulära körteln och bakre magen i den digastriska muskeln och cauterize. Leta reda på och exponera den beniga bullan genom att identifiera sternocleidomastoidmuskeln och ansiktsnerven som sträcker sig främre mot bulla. Öppna den beniga bullan med en 30 gauge nål och ta försiktigt bort det omgivande benet med kirurgisk pincett för att ge en tydlig bild av den cochleära och stapediala artären med sin mediala marginal som ligger över kanten av den runda fönsternischen och orsakar främre överlägsen mot det ovala fönstret.Använd ett litet knivblad för att skrapa sidoväggsbenet vid mussnäckans toppvarv cirka 1,25 millimeter från toppen tills en tunn fläck är sprucken. Ta bort benflisen med små trådkrokar. Täck kärlfönstret med en kapad täckglidning för att bevara normala fysiologiska förhållanden och ge en optisk vy för inspelning av fartygsbilder.Gör ett snitt på en centimeter längs den högra saphenösa venen för att exponera kärlet. Infusera successivt 100 mikroliter vardera av FITC-Dextran-lösningen och blodcellssuspensionen i djuret genom den saphenösa venen för att möjliggöra visualisering av blodkärlen och spårning av blodflödet. Observera blodflödet i realtid på en videomonitor fem minuter efter injektionen.Avbilda blodkärlen med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med ett mål för långt arbetsavstånd och ett lamphus som innehåller ett excitationsfilter med flera band och kompatibelt emissionsfilter. Spela in videon med en högupplöst digital svartvit laddningskopplad enhetskamera som tar mer än 350 bilder per video. För att säkerställa framgångsrik analys av flödeshastigheten.Mät kärldiametern med lämplig programvara och bestäm avståndet mellan två fasta punkter över fartyget i de förvärvade bilderna. Öppna videon av blodflödet i programvaran och ställ in bildernas skala. Spåra de valda DiO-färgade blodkropparna med hjälp av spårningsfunktionen.Använd sedan avståndet som cellerna har flyttat och tidsintervallet mellan bildramar i videon för automatisk beräkning av flödeshastigheten. Beräkna det volymetriska flödet med hjälp av ekvationen som anges i textmanuskriptet. För att skapa bullerexponeringsmodellen före blodflödesregistrering, placera djuren i trådnätburar och utsätt dem för bredbandsbrus vid 120 decibel ljudtrycksnivå i en ljudexponeringsbås i tre timmar.Sedan i ytterligare tre timmar nästa dag. Spela in blodflödet två veckor efter bullerexponering. Efter kirurgisk exponering av de cochleära kapillärerna i sidoväggen utfördes intravital högupplöst fluorescensmikroskopisk observation av DiL-märkta blodkroppar i FITC Dextran-märkta kärl genom ett öppet kärlfönster.DiL-märkta blodkroppar i Stria-kärl märkta med FITC Dextran visas här. Dio-märkta blodkroppar märkta med FITC Dextran visar att kärltätheten hos spiralbandet är glesare än den hos den tätare Stria vascularis. Högupplöst IVM visar blodflödesmönstren i kontroll- och bullerutsatta grupper.Det störda mönstret för blodcirkulationen kan ses i de bullerutsatta grupperna. Anomalier inkluderade minskad kärldiameter och ökad variation i kärldiameter. Blodflödeshastigheterna i kontroll- och brusexponerade grupper beräknades genom att spåra rötterna till de DiO-märkta blodkropparna.Blodhastigheten och volymen i den bullerexponerade gruppen var signifikant lägre än i kontrollgruppen. En framgångsrik etablering av det öppna kärlfönstret kräver en hög grad av kirurgisk skicklighet. Försiktighet måste utövas för att avlägsna benet på den cochleära sidoväggen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Visualisering och analys av blodflöde och syreförbrukning i Nedsatt Mikrocirkulationen: Ansökan om att en akut hepatit modell

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

En Orthotopic Glioblastoma musmodell Underhålla hjärnan parenkymal fysiska begränsningar och Passar Intravital Två-foton mikroskopi

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Automatiserad Mätning av blodcirkulationens Blood Flow Velocity i Lung Metastaser av råttor

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Utvärdering av Planar-Cell-polaritet fenotyper i Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Kombinerade Intravital mikroskopi och kontrastförstärkt ultraljud av mus bakbenet för att studera Insulin-inducerad vasodilatation och muskel Perfusion

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Intravital mikroskopi och trombos induktion i örsnibben av en hårlös mus

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

En kronisk kardiell ischemi modell hos svin med en Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Samtidiga EKG inspelning och invasiv blod tryck mätning hos råttor

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Samtidig flödescytometrisk karakterisering av flera cell typer Hämtad från mushjärna/ryggmärg genom olika Homogeniseringsmetoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...