Name: measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Bu araştırma NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nden (OHSU) Tıbbi Araştırma Vakfı (X.Shi) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu hayatta kalmayan bir ameliyattır. Hayvanların kullanımını içeren tüm prosedürler, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (IACUC onay numarası: TR01_IP00000968).
1. Floresan etiketli kan hücrelerinin hazırlanması
<ol><li>Donör fareleri (~ 6 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri) intraperitoneal (i.p.) ketamin / ksilazin anestezik çözeltisi enjeksiyonu ile anestezik ...

<ol>
	<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation.">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li><li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice.">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li><li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+[corrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research.">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li><li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention.">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li><li>Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow.">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li><li>Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings.">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+cochlear+blood+flow.">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound-induced+cochlear+ischemia/hypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss.">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).</li><li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders.">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).</li><li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants.">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li><li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+(ALDF).">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li><li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser+Doppler:+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow.">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li><li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI.">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li><li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy.">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li><li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy.">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology &amp; Neurotology. 27 (2), 144 (2006).</li><li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system.">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).</li><li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow.">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li><li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo.">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li><li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography.">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li><li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system.">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea.">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li><li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+blood+flow:+measurement+techniques.">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li><li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li><li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+platelets+from+mouse+blood.">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow.">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li><li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow.">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652 (2011).</li><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor.">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis.">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li><li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry.">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li></ol>

Bu yazıda, bir fare modelinin koklear lateral duvarındaki (ve stria vascularis'teki) kılcal damarların, bir FIVM sistemi altında açık bir kap penceresi hazırlığında florofor etiketleme ile nasıl görselleştirilebileceği gösterilmektedir. Fare modeli, insan sağlığı ve hastalıklarının araştırılmasında memeli modeli olarak yaygın olarak kullanılmakta ve tercih edilmektedir. Burada açıklanan protokol, FIVM sistemi altında açık bir damar penceresi kullanarak fare lateral duvarında (özellikle...

Lateral koklear duvardaki mikrosirkülasyonun normal fonksiyonu (spiral ligament ve stria vascularis'teki kılcal damarların çoğunluğunu içerir) işitme fonksiyonunun korunması için kritik öneme sahiptir1. Anormal CoBF, gürültüye bağlı işitme kaybı, kulak hidrops ve presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9 dahil olmak üzere birçok iç kulak bozukluğunun patofizyolojisinde rol oynar. İntravital CoBF'nin görselleştirilmesi, işitme fonksiyonu ile koklear vasküler patoloji arasındaki bağlantıların daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Kokleanın temporal kemik içindeki karmaşıklığı ve yeri, CoBF'nin doğrudan görüntülenmesini ve ölçülmesini engellese de, CoBF'nin değerlendirilmesi için lazer-doppler flowmetri (LDF)10,11,12, manyetik rezonans görüntüleme (MRG)13, floresan intravital mikroskopi (FIVM)14, floresan mikroendoskopi (FME)15, endoskopik lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI)16 gibi çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. ve etiketli belirteçlerin ve radyoaktif olarak etiketlenmiş mikrosferlerin kan dolaşımına enjeksiyonuna dayanan yaklaşımlar (optik mikroanjiyografi, OMAG)17,18,19,20. Bununla birlikte, bu yöntemlerden hiçbiri, FIVM hariç, CoBF'deki değişikliklerin in vivo olarak mutlak gerçek zamanlı izlenmesini sağlamamıştır. FIVM, lateral koklear duvardaki bir damar penceresi ile birlikte, çeşitli laboratuvarlar tarafından farklı deney koşulları altında kobaylarda kullanılan ve doğrulanan bir yaklaşımdır 14,21,22.
Kontrast madde olarak floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran ve bir floresan boya (3, 3′-dioktadesiloksakarbosiyanin perklorat, yeşil) veya Dil (1,1-dioktadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, red) kullanılarak faredeki koklear mikrosirkülasyondaki yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri incelemek için bir FIVM yöntemi başarıyla oluşturulmuştur. Bu çalışmada, normal ve patolojik koşullar altında (gürültüye maruz kaldıktan sonra olduğu gibi) farede CoBF'deki değişiklikleri görüntülemek ve ölçmek için bu yöntemin protokolü tanımlanmıştır. Bu teknik, araştırmacıya, özellikle hazır transgenik fare modelleriyle birlikte uygulandığında, stria vascularis'teki işitme disfonksiyonu ve patoloji ile ilgili CoBF'nin altta yatan mekanizmalarını araştırmak için gereken araçları sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-1966-02</td>
			<td>0.6 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>468495</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3&#8242;-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4292</td>
			<td>20 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CODA Monitor system</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td></td>
			<td>CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of vessel diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (2000 kDa)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD2000s</td>
			<td>40 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP MDV</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>NDC 67457-374-12</td>
			<td>5000 USP units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katathesia (100 mg/mL)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0702-1</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>378-823-5</td>
			<td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-ER Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td>Model: C4742-80-12AG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2085387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use )</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>LPFL04821</td>
			<td>0.2 mL (for 1 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Model: SZ61, fluorescent microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of strial blood flow in mouse cochlea utilizing an open vessel-window and intravital fluorescence microscopy

Sesin iletimi metabolik olarak zordur ve mikrovaskülatürün lateral duvardaki normal fonksiyonu endokoklear potansiyeli, iyon taşınımını ve sıvı dengesini korumak için kritik öneme sahiptir. İşitme bozukluklarının farklı formlarının kokleada anormal mikrosirkülasyon içerdiği bildirilmiştir. Koklear kan akımı (CoBF) patolojisinin işitme fonksiyonunu nasıl etkilediğinin araştırılması, uygulanabilir sorgulama yöntemlerinin eksikliği ve iç kulağa erişimdeki zorluk nedeniyle zordur. Lateral koklear duvardaki açık bir damar penceresi, floresan intravital mikroskopi ile birlikte, CoBF değişikliklerini in vivo olarak incelemek için kullanılmıştır, ancak çoğunlukla kobayda ve sadece son zamanlarda farede. Bu makale ve ilgili video, fare kokleasındaki kan akışını görselleştirmek için açık damar penceresi yöntemini açıklamaktadır. Ayrıntılar arasında 1) farelerden floresan etiketli kan hücresi süspansiyonunun hazırlanması; 2) anestezi uygulanan bir farede intravital mikroskopi için açık bir damar penceresinin oluşturulması ve 3) görüntülemenin çevrimdışı bir kaydını kullanarak kan akış hızının ve hacminin ölçülmesi. Yöntem, normal ve patolojik koşullar altında koklear mikrosirkülasyondaki yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri araştırmak için farede açık pencere yaklaşımının nasıl kullanılacağını göstermek için video formatında sunulmuştur.

Yanal duvardaki koklear kılcal damarların cerrahi maruziyetinden sonra (Şekil 1), FITC-dekstran etiketli damarlarda Dil etiketli kan hücrelerinin intravital yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobik gözlemi açık bir damar penceresinden mümkün olmuştur. Şekil 2A, FIVM altında çekilmiş ve fare koklear tepe orta dönüş yanal duvarının kılcal damarlarını gösteren temsili bir görüntüdür. Bu damarların ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Floresan izleyiciler kullanan açık damar-pencere yaklaşımı, koklear kan akışı (CoBF) ölçümü için yeterli çözünürlük sağlar. Yöntem, normal ve patolojik koşullar altında farede CoBF'deki yapısal ve fonksiyonel değişikliklerin incelenmesini kolaylaştırır.

Açık Damar Penceresi ve İntravital Floresan Mikroskobu Kullanılarak Fare Kokleasında Strial Kan Akışının Ölçülmesi

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Kokleaya normal kan akışı, koklea Meniere Hastalığı için, özellikle saç hücrelerinin işlemi için gerekli itici güç olan iç mekan koklear potansiyelini korumak için kritik öneme sahiptir. Kan dolaşımının bu işlevi, farklı işitme kaybı biçimleriyle yakından ilişkilendirilmiştir. Koklear kan akımının daha iyi anlaşılması, kan akımı disfonksiyonundan kaynaklanan işitme bozukluklarının daha etkili bir şekilde yönetilmesini sağlayacaktır.Bununla birlikte, doğrudan kan akımı ölçümü, iç kulağın değerlendirilmesinin zorluğu nedeniyle çok çok zordur. Koklear kan akışını değerlendirmek için teknikler şu anda hala geliştirilme aşamasındadır. Burada, fare gibi küçük hayvan türlerinde koklear kan akışını daraltmak için yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu ile konaklama birimlerinde laboratuarımızda kurulan son yöntemlerden birini açık kas penceresinde gösteriyoruz.Bu tekniğin transgenetik kitle modelleri ile uygulanması, intravasküler riskte işitme fonksiyonu ile koklear kan akımı ile ilgili patoloji arasındaki bağlantıları çözmek için araştırmaları ilerletme potansiyeline sahiptir. Prosedürlerimiz dikkatli bir şekilde yürütülmelidir. Anlık vücut kanamasına ek olarak, kan basıncı ve kalp atışı da dahil olmak üzere hayvanın hayati belirtileri ameliyatınız sırasında izlenmelidir.Kardiyak ponksiyon yoluyla heparinde yaklaşık bir milimetre kan toplayarak başlayın. Kanı dört santigrat derecede üç dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüj edin. Plazmayı çıkarın, ardından kan hücresi peletini bir mililitre PBS ile üç kez 3000 kez G'de santrifüjleme yoluyla dört santigrat derecede üç dakika boyunca yıkayın.Kan hücrelerini PBS'de bir mililitre 20 mikromolar DiO veya Dil ile etiketleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. Etiketli kan hücrelerini bir mililitre PBS ile yıkayın ve üç dakika boyunca 3000 kez G'de üç kez santrifüj yapın. Enjeksiyondan önce hücre peletini yaklaşık 0.9 mililitre PBS ile% 30 hematokrit içinde yeniden askıya alın.Steril cerrahi aletler ve görüntüleme platformu hazırlayın ve örtünün altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Anestezinin derinliğini kontrol etmek için anestezi uygulanan farelerin zayıf refleksini ve genel kas tonusunu izleyin. Kan basıncını ve kalp atışını izlemek için hayvanı sıcak ısıtma yastığına ve kuyruğunu monitör sistemine yerleştirin.Rektal sıcaklığı 37 santigrat derecede tutun ve hayvanın sistolik kan basıncını, diyastolik kan basıncını ve anestezi altındaki durumda ortalama kan basıncını kaydedin. Sol timpanik bullayı stereo mikroskop altında lateral ve vental bir yaklaşımla açın ve timpanik membranı ve kemikçikleri sağlam bırakın. Hareketi en aza indirmek için hayvanın boynunun orta çizgisi boyunca, başı hareketsiz olacak şekilde bir kesi yapın.Sol sub mandibuler bezi ve digastrik kasın arka göbeğini çıkarın ve koterize edin. Sternokleidomastoid kası ve bulla'ya doğru anterior uzanan fasiyal siniri tanımlayarak kemikli bullayı bulun ve ortaya çıkarın. Kemikli bullayı 30 gauge iğne ile açın ve yuvarlak pencere nişinin kenarında uzanan ve oval pencereye doğru ön üstünlüğe neden olan medial marjı ile koklear ve stapedial arterin net bir görünümünü sağlamak için çevredeki kemiği cerrahi cımbızla dikkatlice çıkarın.Fare kokleasının tepe orta dönüşünde, ince bir nokta çatlayana kadar tepeden yaklaşık 1,25 milimetre uzaktaki yanal duvar kemiğini kazımak için küçük bir bıçak bıçağı kullanın. Kemik yongalarını küçük tel kancalarla çıkarın. Normal fizyolojik koşulları korumak ve damar görüntülerini kaydetmek için optik bir görünüm sağlamak üzere kap penceresini kesilmiş bir kapak kayması ile örtün.Damarı açığa çıkarmak için sağ safen damar boyunca bir santimetrelik bir kesi yapın. FITC-Dextran çözeltisinin her birine 100 mikrolitre ve kan hücresi süspansiyonunu, kan damarlarının görselleştirilmesini ve kan akışının izlenmesini sağlamak için safen damarından hayvana art arda infüze edin. Enjeksiyondan beş dakika sonra bir video monitöründe kan akışını gerçek zamanlı olarak gözlemleyin.Uzun bir çalışma mesafesi hedefi ve çoklu bant uyarma filtresi ve uyumlu emisyon filtresi içeren bir lamba muhafazası ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak kan damarlarını görüntüleyin. Video başına 350'den fazla görüntü elde eden yüksek çözünürlüklü dijital siyah beyaz şarj bağlantılı cihaz kamerasını kullanarak videoyu kaydedin. Akış hızının başarılı bir şekilde analiz edilmesini sağlamak.Uygun yazılımı kullanarak kap çapını ölçün ve elde edilen görüntülerde gemi boyunca iki sabit nokta arasındaki mesafeyi belirleyin. Yazılımdaki kan akışı videosunu açın ve görüntülerin ölçeğini ayarlayın. İzleme işlevini kullanarak seçilen DiO lekeli kan hücrelerini izleyin.Ardından, akış hızının otomatik olarak hesaplanması için hücrelerin hareket ettiği mesafeyi ve videodaki görüntü kareleri arasındaki zaman aralığını kullanın. Metin yazısında verilen denklemi kullanarak hacimsel akışı hesaplayın. Kan akışı kaydından önce gürültüye maruz kalma modelini oluşturmak için, hayvanları tel örgü kafeslere yerleştirin ve üç saat boyunca bir ses maruz kalma kabininde 120 desibel ses basıncı seviyesinde geniş bant gürültüsüne maruz bırakın.Sonra ertesi gün üç saat daha. Gürültüye maruz kaldıktan iki hafta sonra kan akışını kaydedin. Lateral duvardaki koklear kılcal damarların cerrahi maruziyetinden sonra, FITC Dextran etiketli damarlardaki DiL etiketli kan hücrelerinin intravital yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobik gözlemi açık bir damar penceresinden gerçekleştirildi.FITC Dextran ile etiketlenmiş Stria damarlarındaki DiL etiketli kan hücreleri burada gösterilmiştir. FITC Dextran ile etiketlenmiş Dio etiketli kan hücreleri, spiral ligamentin damar yoğunluğunun daha yoğun Stria vascularis'inkinden daha seyrek olduğunu göstermektedir. Yüksek çözünürlüklü IVM, kontrol ve gürültüye maruz kalan gruplardaki kan akış modellerini gösterir.Gürültüye maruz kalan gruplarda bozulmuş kan dolaşımı paterni görülebilir. Anomaliler arasında damar çapının azalması ve damar çapının artması sayılabilir. Kontrol ve gürültüye maruz kalan gruplardaki kan akış hızları, DiO etiketli kan hücrelerinin kökleri izlenerek hesaplandı.Gürültüye maruz kalan gruptaki kan hızı ve hacmi kontrol grubuna göre anlamlı derecede düşüktü. Açık damar penceresinin başarılı bir şekilde kurulması, yüksek derecede cerrahi beceri gerektirir. Koklear lateral duvarın kemiğinin çıkarılmasına özen gösterilmelidir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Akut Hepatit Model Uygulama: Görselleştirme ve Hepatik Mikrosirkülasyon Kan Akış ve Oksijen Tüketimi Analizi

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Sıçan Pulmoner METASTAZLARINDA Mikrosirkülasyonda Kan Akışı Hızının Otomatik Ölçüm

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Intravital mikroskobu ve kontrast-artırılmış Ultrasonografi fare Hindlimb, insülin kaynaklı vazodilatasyon ve kas perfüzyon çalışmaya kombine

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Bir Tüysüz fare kulak memesi içinde intravital Mikroskopi ve trombüs İndüksiyon

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Bir Ameroid yılanı kullanarak domuz kronik kalp iskemi modelinde

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Eşzamanlı elektrokardiyografi kayıt ve invaziv kan basınç ölçüm sıçanlarda

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Farklı Homojenizasyon Yöntemleri ile Fare Beyin/Omurilikten Alınan Çoklu Hücre Tiplerinin Eşzamanlı Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...