Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (R43GM125420 وR44GM125420).

1. تركيب أنبوب الشعرية
<ol><li>باستخدام الحجر السيليكا cleaving، يشق 250 ميكرومتر القطر الداخلي (معرف) السيليكا الشعرية إلى 27 بوصة. تحقق من النهايات الشعرية للحصول على قطع نظيفة ومستقيمة.</li>
	<li>إنشاء نافذتين تقريبا 15 ملم في الطول عن طريق حرق بعيدا طلاء البوليميد. بدءا من "الطرف السفلي" جعل نافذة الت?...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

هناك العديد من الخطوات الحاسمة لضمان وضع العلامات المناسبة للبروتينات خلال أي تجربة HRPF. أولا، يتم تحديد معدل تدفق مناسب ومعدل فلاش المصدر للتأكد من أن كل بولوس من العينة مشع مرة واحدة. وهذا يضمن أن يتعرض البروتين لبول واحد من oh ▪OH التي تشكلت حديثا. بمجرد أكسدة البروتين ، يمكن تغيير ب?...

تشكيل البروتين وما يرتبط به من بنية النظام الأعلى (HOS) هي المحددات الرئيسية للوظيفة البيولوجية السليمة والسلوك الشاذ1. وينطبق الشيء نفسه على المستحضرات الصيدلانية الحيوية، التي يعتمد هيكلها ونشاطها الوظيفي على جوانب مختلفة من إنتاجها وبيئتها. وقد تم ربط التغير الصيدلاني الحيوي في HOS إلى ردود الفعل الدوائية السلبية (ADR) المنسوبة إلى الصيدلة غير المرغوب فيها والاستجابة المناعية للمريض2،3. وقد نبه ظهور ADRs صناعة الأدوية الحيوية إلى الدور الحاسم الذي يلعبه البروتين HOS في سلامة وفعالية العلاج الحيوي ، وأنها أثبتت الحاجة إلى تحليلات HOS جديدة ومحسنة4.
هيدروكسيل البروتين الراديكالي البصمة (HRPF) هو تقنية واعدة لتتبع التغيير في البروتين HOS. HRPF ينطوي على وضع علامات لا رجعة فيها من السطح الخارجي للبروتين مع ▪OH تليها تحليل الطيف الكتلي (MS) لتحديد سطح المذيبات التي يمكن الوصول إليها من البروتين5،6،7. HRPF وقد استخدمت بنجاح للكشف عن عيوب في البروتين HOS ووظيفته8،9، تميز هوس من الأجسام المضادة أحادية النسيلة (ماب)10،11،12،13، تحديد KD ملزمة من14ليغاند ، وأكثر من ذلك بكثير15،16،17،18،19. وهناك طريقة شائعة لتوليد ▪OH لHRPF هو الأكسدة الضوئية السريعة للبروتينات (FPOP) ، والذي يستخدم عالية الطاقة ، وأشعة الليزر فوق البنفسجية السريعة لإنتاج ▪OH من التحليل الضوئي من H2O2. بالنسبة للجزء الأكبر، FPOP يستخدم الليزر إكسيمر مكلفة تستخدم الغاز الخطرة (KrF) التي تتطلب ضمانات كبيرة لتجنب إصابات الجهاز التنفسي والعين20. لتجنب مخاطر الاستنشاق، استخدم آخرون تردد أربع مرات النيودميوم yttrium العقيق الألومنيوم (Nd:YAG) الليزر21،الذي يلغي استخدام الغاز السام ولكن لا تزال مكلفة، وتتطلب خبرة عملية كبيرة، والمطالبة بضوابط واسعة النطاق ضوء ضالة لحماية المستخدمين من إصابات العين.
على الرغم من أنه يمكن الحصول على معلومات وافرة باستخدام HRPF ، لم يتم الوفاء بالتبني الواسع النطاق في biopharma. 21- ومن بين العوائق التي تحول دون اعتماد قوة حماية حقوق الإنسان المحدودة: 1) استخدام الليزر الخطر والمكلف الذي يتطلب احتياطات أمان كبيرة 20؛ (2) استخدام أجهزة الليزر الخطرة والمكلفة التي تتطلب احتياطات كبيرة للسلامة 20؛ (2) استخدام الليزر الخطر والمكلف الذي يتطلب احتياطات أمان كبيرة20؛ (2)استخدام الليزر الخطر والمكلف الذي يتطلب احتياطات أمان كبيرة و 2) عدم قابلية الحماية من HRPF الناجمة عن مسح الخلفية من ▪OH التي تحد من الدراسات المقارنة22. لتحل محل استخدام الليزر، تم تطوير وحدة تحلل ضوئي عالية السرعة وعالية الطاقة بالبلازما لأداء FPOP بأمان بطريقة سهلة. لتحسين عدم قابلية عدم الحماية لتجارب HRPF ، يتم تنفيذ قياس الجرعات الراديكالية في الوقت الحقيقي.
وقد تم الحد من ممارسة HRPF من عدم القابلية لدحض يعزى إلى مسح الخلفية من ▪OH22. في حين أن ▪OH هي مسابير ممتازة من تضاريس البروتين ، إلا أنها تتفاعل أيضا مع العديد من المكونات الموجودة في الاستعدادات ، مما يجعل من الضروري قياس التركيز الفعال للراديكالية المتاحة لأكسدة البروتين المستهدف. يمكن أن تؤدي الاختلافات في إعداد العازلة ، وتركيز بيروكسيد الهيدروجين ، وخصائص الليغند ، أو التحلل الضوئي إلى اختلافات الأكسدة بين مجموعات التحكم والتجريبية التي تخلق غموضا في الدراسات التفاضلية HOS. إضافة قياس الجرعات الراديكالية في الوقت الحقيقي تمكن من تعديل تأثير ▪تحميل OH وبالتالي يزيد من الثقة والتكرار خلال تجربة HRPF. وقد وصف استخدام قياس الجرعات الراديكالية في FPOP في مكان آخر23،24،25، ويناقش بمزيد من التفصيل في منشور صدر مؤخرا26. هنا، ونحن نصف استخدام نظام التحلل الضوئي فلاش رواية وقياس الجرعات في الوقت الحقيقي لتسمية الخيول آبو-الميوجلوبين (AMb)، مقارنة مستويات أكسدة الببتيد في تجربة FPOP لتلك التي تم الحصول عليها عند استخدام ليزر إكسيمر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

Hydroxyl الراديكالية البروتين البصمة (HRPF) هو الناشئة والواعدة أعلى ترتيب تقنية التحليل الهيكلي الذي يوفر معلومات عن التغيرات في بنية البروتين، والتفاعلات البروتين البروتين، أو التفاعلات البروتين ليغاند. HRPF يستخدم الجذور الهيدروكسيل(▪OH) لتسمية لا رجعة فيه سطح المذيبات البروتين يمكن الوصول إليها. وقد حد التعقيد المتأصل في أداء الشراكة البشرية المحمية وتكلفته وطبيعته الخطرة إلى حد كبير من الاعتماد الواسع النطاق في مجال الصيدلة الحيوية. وتشمل هذه العوامل: 1) استخدام الليزر المعقد والخطير والمكلف الذي يتطلب احتياطات أمان كبيرة؛ (2) استخدام أجهزة الليزر المعقدة والخطرة والمكلفة التي تتطلب احتياطات أمان كبيرة؛ (2) استخدام أجهزة الليزر المعقدة والكواية التي تتطلب احتياطات كبيرة للسلامة؛ (2) استخدام أجهزة الليزر المعقدة والكواية و 2) عدم قابلية الحماية من HRPF الناجمة عن مسح الخلفية من ▪OH التي تحد من الدراسات المقارنة. يوفر هذا المنشور بروتوكولا لتشغيل نظام HRPF خال من الليزر. يستخدم نظام HRPF الخالي من الليزر تقنية أكسدة فلاش مصدر ضوء البلازما عالية الطاقة والضغط العالي مع قياس الجرعات الراديكالي في الخط. مصدر ضوء البلازما هو أكثر أمانا، وأسهل في الاستخدام، وأكثر كفاءة في توليد الجذور الهيدروكسيل من أنظمة HRPF القائمة على الليزر، ومقياس الجرعات الراديكالية في الخط يزيد من استنساخ الدراسات. وإلى جانب ذلك، يعالج نظام HRPF الخالي من الليزر النقائص والقيود المذكورة في التقنيات القائمة على الليزر ويتغلب عليها.

مصدر البلازما عالي الضغط إلى جانب قياس الجرعات في الوقت الحقيقي يسمح بالتحكم بشكل أفضل في ▪OH لمراقبة التغيرات في بنية البروتين الأعلى ترتيبا بشكل أكثر دقة. إضافة أدينين يسمح لجرعات جذرية فعالة في الوقت الحقيقي. عند الأكسدة، الأدينين يفقد امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 265 نانومتر (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

يقدم هذا البروتوكول طريقة لاستخدام قياس الجرعات الراديكالي المضمن ومصدر ضوء البلازما لأداء بصمة بروتين أكسدة الفلاش. هذه الطريقة تحل محل ليزر الأشعة فوق البنفسجية الخطرة لتبسيط وتحسين استنساخ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة لدراسات البروتين.

ليزر خالية من هيدروكسيل البروتين الراديكالي البصمة لأداء أعلى ترتيب التحليل الهيكلي للبروتينات

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

يجعل تأثير البروتين الراديكالي الهيدروكسيل الخالي من الليزر تحديد مواقع التفاعل البروتيني ومناطق التغيير التأكيدي أسهل بكثير ، مما يسرع الأبحاث في دراسات تجميع البروتين وهيكله واستقراره. مع قياس الجرعات الراديكالي المضمن ، يمكن للمستخدمين ضبط الحمل الراديكالي الهيدروكسيل الفعال في الوقت الفعلي ، ومع قياس الجرعات الراديكالي في الوقت الحقيقي ، يمكنك توفير الوقت التجريبي والعينة الثمينة مع تحسين قابلية التكرار. للبدء، يلتصق 250 ميكرومتر داخلي السيليكا الشعرية إلى 27 بوصة مع الحجر السيليكا شق، والتحقق من نهايات الشعرية لقطع نظيفة ومستقيمة.إنشاء نافذتين من طول 15 ملليمتر تقريبا. من الطرف السفلي من الشعرية، وحرق بعيدا طلاء البوليميد 90 ملليمتر لإنشاء نافذة التحلل الضوئي و 225 ملليمتر لنافذة مقياس الجرعات. إدراج الطرف السفلي من الشعرية فقط وراء نهاية مخروطية من الجوز والنمس.إضافة الشعيرات الدموية إلى الميناء الخامس، تشديد فقط وراء إصبع ضيق مع وجع. قم بإزالة غطاء خلية التحلل الضوئي لوحدة التحلل الضوئي عن طريق سحبه مباشرة ، ثم قم بإزالة القناع المعدني المثبت مغناطيسيا ، والذي سيمسك الشعيرات الدموية في مكانها. افتح خلية مقياس الجرعات عن طريق الضغط على علامة التبويب على اليسار وتأرجح خلية مقياس الجرعات المفتوحة إلى اليمين.إزالة مقاطع محمولة مغناطيسيا التي من شأنها أن تعقد الشعرية في مكان. ثم ضع الشعرية في القناة المخدودة في قاعدة خلية التحلل الضوئي ، وتمركز النافذة الشعرية مع نافذة خلية التحلل الضوئي. عقد الشعرية في الموقف وإضافة القناع المغناطيسي.ضع غطاء التحلل الضوئي مرة أخرى في موضعه. ضع الشعيرات الدموية في القناة المخدودة في قاعدة خلية الجرعات ، وتمركز النافذة الشعرية الثانية على الفتحة الصغيرة في وسط خلية مقياس الجرعات. في حين عقد الشعرية في موقف بيد واحدة، وضع اثنين من مقاطع المغناطيسي في موقف لعقد الشعرية في مكان.أغلق الخلية مقياس الجرعات حتى النقر فوق مغلق. وأخيرا، أدخل الشعرية من خلال مقبض knurled فوق رفع الشعرية من جامع المنتج، وتوسيع الشعرية إلى أعلى الجزء السفلي من القارورة. قطع الطول المطلوب من أنابيب تفلون باستخدام القاطع والتحقق من نهايات لقطع مستقيم نظيفة.إدراج نهاية واحدة من حلقة حقن جديدة من خلال واحدة من المكسرات، ووضع فيرول جديدة على نهاية الأنبوب. عقد الجوز والنمس في مكان أثناء إدخال الأنبوب في ميناء ستة من صمام الحقن حتى قيعان بها. تشديد الجوز مع وجع، ثم تأكد من أن الجوز والنمس هي آمنة في مكان.مرة واحدة كلا طرفي الجوز والمعادن الثابتة، المسمار فضفاضة نهاية واحدة إلى ميناء ثلاثة والطرف الآخر إلى ميناء ستة. مرة واحدة في الموقف، وتشديد كلا الجانبين إلى إصبع ضيق، ثم ربع بدوره الاصبع الماضي ضيق مع وجع. قم بتشغيل نظام HRPF الخالي من الليزر من خلال بدء تشغيل وحدة fluidics ، تليها وحدة التحلل الضوئي ، وحدة قياس الجرعات ، جامع المنتج ، وكمبيوتر النظام.تشغيل برنامج النظام. غمر الأنبوب بالكامل إلى 10 ملليلترات من العازلة من وضع الصمام على مضخة الحقنة. توجيه الأنابيب من وضع النفايات والأنابيب من الميناء الثاني على منفذ الحقنة إلى حاوية فارغة لجمع النفايات.ضع أنابيب 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيق في الموضع الذي تم وضع علامة HN6 عليه. شطف خارج حلقة الحقن خمس مرات عن طريق حقن 25 ميكرولتر من الماء HPLC الصف مع صمام تعيين إلى موقف الحمل. قم بتشغيل صمام الحقن يدويا لطرد بقية النظام.حدد عملية على برنامج التحكم لبدء تدفق المياه حتى تتشكل قطرة. جعل الحل الذي يحتوي على اثنين من الأدينين الميليمولار و 10 بروتين ميكرومولار. ثم جعل محلول إخماد باستخدام 0.3 ملليغرام لكل كاتالاز ملليلتر و 35 ملليمولار ميثياين أميد.Aliquot 25 ميكرولتر من محلول إخماد في أنبوب صغير 200 ميكرولتر. تمييع بيروكسيد الهيدروجين إلى 200 ملليمولار، وإبقائه على الجليد. بدء الجهد فلاش في صفر فولت على برنامج التحكم.هذا التحكم صفر فولت ستحدد أي أكسدة الخلفية على البروتين من الفائدة. حدد بدء تشغيل البيانات AutoZero، متبوعا بعملية ثم جاهز. وأخيرا، قم بتحويل صمام الحقن إلى موضع التحميل.ضع محلول التبريد في الموضع الأول على دائري جامع المنتج ، ثم قم بتغيير قارورة المنتج إلى واحدة على برنامج التحكم في النظام. قبل الحقن مباشرة، اخلط 12.5 ميكرولتر من خليط الأدينين والبروتين مع 12.5 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين. ماصة الخليط صعودا وهبوطا لخلط، ثم تدور بسرعة عليه.حقن 25 ميكرولتر من هذا الحل باستخدام منفذ الحقن في غضون 10 ثانية من الاختلاط. قم بتبديل صمام الحقن إلى موضع الحقن وانتظر أثناء معالجة العينة. بدوره تصل الجهد فلاش إلى 750 فولت على برنامج التحكم، وتكرار خطوات وضع العلامات.ثم سجل امتصاص كل عينة. أولا، انقر فوق تحديد، ثم حدد بداية ونهاية امتصاص الذروة يدويا. في المساحة المتوفرة، اكتب وصفا للعينة.كرر ذلك لجميع البيانات المكتسبة. نسخ ولصق البيانات في جدول بيانات لحساب متوسط التغير في امتصاص أدينين لكل جهد. بعد جمع جميع العينات، طرد منفذ الحقنة وحلقة العينة عن طريق وضع صمام الحقن وصولا الى موقف الحمل وحقن 25 ميكرولتر من المياه HPLC خمس مرات.قم بتشغيل صمام الحقن حتى موضع الحقن لطرد بقية النظام بماء HPLC. مسح مرة واحدة، ووقف تدفق، والخروج من برنامج التحكم في النظام، وإيقاف تشغيل وحدات، بدءا من جامع المنتج، وحدة الجرعات، وحدة التحلل الضوئي، وأخيرا وحدة fluidics. عند الأكسدة، يقلل الأدينين المستخدم لقياس الجرعات في امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 265 نانومتر.يحتوي المخزن المؤقت 2 على زبال جذري، مما يقلل من التغير في امتصاص الأدينين مقارنة بالمخزن المؤقت 1. تم تعديل Apomyoglobin في وجود بيروكسيد الهيدروجين والاديدين في أربعة الفولتية مصباح البلازما المتزايد. تم الكشف عن ستة الببتيدات، مع زيادة خطية في الأكسدة فيما يتعلق بتغيير امتصاص الأدينين في 265 نانومتر.هذه الببتيدات الستة المؤتأكسدة توصف على بنية بلورية من الميوجلوبين. مدى الأكسدة التي تم الكشف عنها من مصباح البلازما الضغط العالي هو أعلى بكثير من طريقة الليزر القائم. تنشأ هذه الزيادة من الطيف العريض لانبعاثات الأشعة فوق البنفسجية لمصباح البلازما عالي الضغط.من خلال إنتاج طيف واسع للأشعة فوق البنفسجية ، يتداخل مصباح البلازما عالي الضغط بشكل أفضل مع مجال امتصاص بيروكسيد الهيدروجين ، مما يؤدي إلى إنتاج أكثر كفاءة لجذور الهيدروكسيل من خلال التحلل الضوئي لبيروكسيد الهيدروجين ، مقارنة بالليزر Kr F Excimer و Nd YAG Laser. يزيد مصباح البلازما عالي الضغط بشكل كبير من إنتاج الجذور الهيدروكسيلية بما يتجاوز ما يلاحظ عادة باستخدام ليزر Kr F Excimer. يمكن أن يسبب استخدام بيروكسيد 100 ملليمولار مستويات عالية من أكسدة الخلفية.إذا كان نظام البروتين عرضة للأكسدة الناجمة عن البيروكسيد، تقليل التركيز إلى أقل من 10 ملليمولار. تسمية HRPF لا رجعة فيه يسمح للتعامل مع عينة المصب، بما في ذلك الهضم بروتياز طويلة، يمكنك إضافة في علامة كتلة جنبا إلى جنب لتعدد، وأداء الكروماتوغرافيا 2D، كل تحسين الكشف عن الببتيد والمعلومات الهيكلية concoordinate.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

الجمع بين الرطب وتقنيات مختبر الجافة لتوجيه بلورة البروتينات كبيرة ملفوف لفائف تحتوي على

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

تعديل ناقلات التعبير باكولوفيروس لإنتاج يفرز البروتينات النباتية في خلايا الحشرات

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

توصيف البروتينات حسب الحجم والاستبعاد الكروماتوغرافيا المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

تحليل بيانات لجنة الأوراق المالية والبورصة -SAXS عن طريق إزالة الفولفورة والإيفاد في EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

إنتاج بروتينات PRMT المؤتلفة باستخدام نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...