Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 og R44GM125420).

1. Installation af kapillærrøret
<ol><li>Ved hjælp af en silica kløvning sten, kløve 250 μm indre diameter (ID) silica kapillær til 27 inches. Kontroller kapillærenderne for et rent, lige snit.</li>
	<li>Opret to vinduer ca. 15 mm i længden ved at brænde polyimidbelægningen væk. Fra den "nederste ende" laves det første fotolysevindue 90 mm væk fra den "nedre ende" og det andet dosimetervindue 225 mm væk fra den "nedre ende". BEMÆRK: Når belægningen er brændt væk kapillæren er meget skrøbelig.</...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

Der er flere kritiske trin for at sikre korrekt mærkning af proteiner under ethvert HRPF-eksperiment. For det første vælges en passende strømningshastighed og kilde flash rate for at sikre, at hver bolus af prøven bestråles én gang. Dette sikrer, at proteinet udsættes for en enkelt bolus af nydannede ▪OH. Når et protein er oxideret, kan den højere orden proteinstruktur ændres. For at være sikker på, at den oprindelige proteinstruktur undersøges, skal hvert proteinmolekyle ændres på et enkelt ...

Proteinformation og tilhørende højere ordensstruktur (HOS) er de vigtigste determinanter for korrekt biologisk funktion og afvigende adfærd1. Det samme gælder for biofarmaceutiske lægemidler, hvis struktur og funktionelle aktivitet er afhængig af forskellige aspekter af deres produktion og miljø. Biofarmaceutiske ændringer i HOS har været forbundet med bivirkninger (ADR), der tilskrives uønsket farmakologi og patientens immunologiskerespons 2,3. Udseendet af BIVIRKNINGER har advaret den biofarmaceutiske industri om den kritiske rolle, som protein HOS spiller i sikkerheden og effekten af bioterapeutiske lægemidler, og de har fastslået behovet for nye og forbedrede HOS-analyser4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en lovende teknik til at spore ændringen i protein HOS. HRPF indebærer uoprettelig mærkning af et proteins ydre med ▪OH efterfulgt af ms-analyse (mass spektrometri) til identifikation af proteinets opløsningsmiddeltilgængelige overflade5,6,7. HRPF er med succes blevet brugt til at opdage defekter i protein HOS og dets funktion8,9, karakteriserer HOS af monoklonale antistoffer (mAb)10,11,12,13, bestemme binding Kd af en ligand14, og meget mere15,16,17,18,19. En almindelig metode til at generere ▪OH for HRPF er Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP), som anvender højenergi, hurtige UV-lasere til at producere ▪OH fra fotolyse af H2O2. FPOP anvender for det meste dyre excimerlasere, der anvender farlig gas (KrF), som kræver betydelige sikkerhedsforanstaltninger for at undgå åndedræts- og øjenskader20. For at undgå indånding farer, andre har brugt frekvens firedoblet neodymium yttrium aluminium granat (Nd:YAG) lasere21, som eliminerer brugen af giftige gas, men er stadig dyrt, kræver betydelig operationel ekspertise, og kræver omfattende omstrejfende lys kontrol for at beskytte brugerne mod øjenskader.
Selv om der kan indhentes rigelige oplysninger ved hjælp af HRPF, er bred anvendelse i biopharma ikke blevet opfyldt. To hindringer for den begrænsede HRPF-vedtagelse omfatter: 1) anvendelse af farlige og dyre lasere, der kræver betydelige sikkerhedsforanstaltninger20; og 2) hrpf's irreproducibilitet som følge af baggrundsudledning af ▪OH, der begrænser sammenlignende undersøgelser22. Til supplant laser brug, en høj hastighed, høj energi plasma flash fotolyse enhed blev udviklet til sikkert at udføre FPOP på en letkøbt måde. For at forbedre irreproducibility af HRPF eksperimenter, real-time radikal dosimetri er gennemført.
Hrpf's praksis har været begrænset af irreproducibility, der tilskrives baggrundsudledning af ▪OH22. Mens ▪OH er fremragende sonder af proteintopografi, reagerer de også med mange bestanddele, der findes i præparater, hvilket gør det nødvendigt at måle den effektive koncentration af radikal, der er tilgængelig for at oxidere et målprotein. Variationer i bufferpræparat, hydrogenperoxidkoncentration, ligandegenskaber eller fotolyse kan resultere i oxidationsforskelle mellem kontrol- og eksperimentelle grupper, der skaber tvetydighed i HOS-differentialundersøgelser. Tilføjelsen af radikal dosimetri i realtid gør det muligt at justere effekten ▪OH-belastning og øger derfor tilliden og reproducerbarheden under et HRPF-eksperiment. Brugen af radikal dosimetri i FPOP er beskrevet andetsteds23,24,25og diskuteres yderligere i detaljer i en nylig publikation26. Her beskriver vi brugen af en ny flash fotolyse system og real-time dosimetri til mærkning heste apo-myoglobin (aMb), sammenligne niveauer af peptid oxidation i en FPOP eksperiment til den opnåede, når du bruger en excimer laser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en ny og lovende strukturanalyseteknik med højere orden, der giver information om ændringer i proteinstruktur, proteinproteininteraktioner eller protein-ligand-interaktioner. HRPF udnytter hydroxylradikaler (▪OH) til uigenkaldeligt at mærke et proteins opløsningsmiddeltilgængelige overflade. Den iboende kompleksitet, omkostninger og farlige karakter af at udføre HRPF har i væsentlig grad begrænset bredt funderet anvendelse i biopharma. Disse faktorer omfatter: 1) brugen af komplicerede, farlige og dyre lasere, der kræver betydelige sikkerhedsforanstaltninger; og 2) den irreproducibility af HRPF forårsaget af baggrund scavenging af ▪OH, der begrænser sammenlignende undersøgelser. Denne publikation indeholder en protokol til drift af et laserfrit HRPF-system. Dette laserfri HRPF-system anvender en højenergi, højtryksplasmalyskilde flash oxidationsteknologi med in-line radikal dosimetri. Plasmalyskilden er sikrere, lettere at bruge og mere effektiv til at generere hydroxylradikaler end laserbaserede HRPF-systemer, og det in-line radikale dosimeter øger reproducerbarheden af undersøgelser. Tilsammen adresserer og overvinder det laserfri HRPF-system de nævnte mangler og begrænsninger ved laserbaserede teknikker.

Højtryksplasmakilden kombineret med dosimetri i realtid giver bedre kontrol over ▪OH-udbytte for at observere ændringer i proteinstrukturen i højere orden mere præcist. Tilføjelsen af adenin giver mulighed for et effektivt radikalt dosimeter i realtid. Ved oxidation mister adenin UV-absorbans ved 265 nm (Figur 2A). Ændringen i adeninabsorpturen er direkte relateret til koncentrationen af radikaler, der er til rådighed for HRPF, hvilket giver mulighed for effektivt at over...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Denne protokol præsenterer en metode til at bruge inline radikal dosimetri og en plasmalyskilde til at udføre flash oxidationsproteinfodaftryk. Denne metode erstatter den farlige UV-laser for at forenkle og forbedre reproducerbarheden af hurtig fotokemisk oxidation af proteinundersøgelser.

Laserfri Hydroxyl Radical Protein Footprinting til at udføre højere orden strukturel analyse af proteiner

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Laserfri hydroxylradikale proteinaftryk gør det meget lettere at identificere proteininteraktionssteder og områder med bekræftelsesændringer, hvilket fremskynder forskning i proteinsammenlægning, struktur og stabilitetsundersøgelser. Med indbygget radikal dosimetri kan brugerne justere den effektive hydroxylradikale belastning i realtid, og med realtidsradikale dosimetri kan du spare eksperimentel tid og dyrebar prøve, samtidig med at du forbedrer reproducerbarheden af mærkning. Til at begynde med, kløve en 250 mikrometer indre diameter silica kapillær til 27 inches med en silica kløvning sten, kontrollere enderne af kapillær for en ren og lige snit.Opret to vinduer med en længde på ca. 15 millimeter. Fra den nederste ende af kapillæren skal du brænde polyimidbelægningen 90 millimeter op for at skabe fotolysevinduet og 225 millimeter til dosimetervinduet. Sæt den nederste ende af kapillæren lige ud over den koniske ende af en møtrik og ferrule.Tilsæt kapillær til port fem, stramning lige ud finger stram med en skruenøgle. Fjern fotolysecellehætten på fotolysemodulet ved at trække det lige ud, og fjern derefter den magnetisk monterede metalmaske, som holder kapillæren på plads. Åbn dosimetercellen ved at trykke på fanen til venstre og svinge dosimetercellen åben til højre.Fjern de magnetisk monterede klip, der holder kapillæren på plads. Placer derefter kapillæren i den rillede kanal i bunden af fotolyscellen, og centrer kapillærvinduet med fotolysecellevinduet. Hold kapillæren på plads, og tilsæt den magnetiske maske.Placer fotolysehætten tilbage på plads. Placer kapillæren i den rillede kanal i bunden af dosimetercellen, og centrer det andet kapillærvindue på den lille blænde i midten af dosimetercellen. Mens du holder kapillæren på plads med den ene hånd, skal du placere de to magnetiske klip på plads for at holde kapillæren på plads.Luk dosimetercellen, indtil den klikker lukket. Til sidst indsættes kapillæren gennem den knurled knop oven på produktets opsamlers kapillærløft, og kapillæren udvides til lige over bunden af hætteglasset. Skær den ønskede længde af Teflon slange ved hjælp af en fræser og kontrollere enderne for en ren lige snit.Sæt den ene ende af den nye injektionssløjfe gennem en af møtrikkerne, og placer en ny ferrule på enden af røret. Hold møtrikken og ferrule på plads, mens du indsætter røret i port seks af injektionsventilen, indtil den bunder ud. Stram møtrikken med en skruenøgle, og bekræft derefter, at møtrikken og ferrule er sikkert på plads.Når begge ender har en møtrik og fast ferrule, løst skrue den ene ende til port tre og den anden ende til port seks. Når du er på plads, skal du stramme begge sider for at finger stramme, så en fjerdedel vender sig forbi fingeren tæt med en skruenøgle. Tænd det laserfri HRPF-system ved at starte fluidics-modulet efterfulgt af fotolysemodulet, dosimetermodulet, produktindsamleren og systemcomputeren.Start systemsoftwaren. Slangen nedsænkes helt i 10 milliliter buffer fra ventilpositionen på sprøjtepumpen. Ret slangen fra affaldspositionen og slangen fra port to på sprøjteporten til en tom beholder for at indsamle affald.Placer 1,5 milliliter mikrocentrifugerør på den position, der er mærket HN6, på produktopsamlerkarrusellen. Skyl injektionssløjfen fem gange ved at injicere 25 mikroliter hplc-vand, mens ventilen er indstillet til belastningspositionen. Vend manuelt injektionsventilen for at skylle resten af systemet.Vælg Proces på kontrolsoftwaren for at begynde at flyde vand, indtil der dannes en dråbe. Lav en opløsning, der indeholder to millimolar adenin og 10 mikromolar protein. Lav derefter en sylteopløsning ved hjælp af 0,3 milligram pr. milliliter catalase og 35 millimolar methianine midt.Aliquot 25 mikroliter af sluk opløsning i en 200 mikroliter mikrorør. Fortynd brintoverilte til 200 millimolar, holde det på is. Start flashspændingen ved nul volt på kontrolsoftwaren.Denne nul volt kontrol vil bestemme enhver baggrund oxidation på protein af interesse. Vælg Start data autozero efterfulgt af Process then Ready. Til sidst drejes injektionsventilen ned til lastpositionen.Sæt slæbeopløsningen på plads på produktets opsamlerkarrusel, og skift derefter produktglasset til et på systemstyringssoftwaren. Umiddelbart før injektion blandes 12,5 mikroliter af adenin- og proteinblandingen med 12,5 mikroliter hydrogenperoxid. Pipette blandingen op og ned for at blande, så hurtigt spin det ned.Der injiceres 25 mikroliter af denne opløsning ved hjælp af injektionsporten inden for 10 sekunder efter blandingen. Skift injektionsventilen til injektionspositionen, og vent, mens prøven behandles. Skru op for flashspændingen til 750 volt på kontrolsoftwaren, og gentag mærkningstrinnene.Registrer derefter absorbansen af hver prøve. Klik først på Markér, og vælg derefter manuelt begyndelsen og slutningen af topabsorpmentet. Skriv i en beskrivelse af eksemplet på den tilgængelige plads.Gentag dette for alle erhvervede data. Kopier og indsæt dataene i et regneark for at beregne den gennemsnitlige ændring i adeninabsorptance for hver spænding. Når alle prøver er indsamlet, skylles sprøjteporten og prøvesløjfen ud ved at indstille injektionsventilen til lastpositionen og injicere 25 mikroliter HPLC-vand fem gange.Drej injektionsventilen op til injektionspositionen for at skylle resten af systemet med HPLC-vand. Når det er skyllet, skal du stoppe flowet, forlade systemstyringssoftwaren og slukke modulerne, begyndende med produktindsamleren, dosimetermodulet, fotolysemodulet og til sidst fluidikmodulet. Ved oxidation falder adenin, der anvendes til dosimetri, i UV-absorbans ved 265 nanometer.Buffer 2 indeholder et radikalt ådselæder, som reducerer ændringen i adeninabsorptance sammenlignet med Buffer 1. Apomyoglobin blev ændret i nærværelse af brintoverilte og adenin ved fire stigende plasmalampespændinger. Seks peptider blev påvist, med en lineær stigning i oxidation med hensyn til ændringen af adenin absorbans ved 265 nanometer.Disse seks oxiderede peptider er mærket på en krystal struktur af myoglobin. Omfanget af oxidation, der påvises fra højtryksplasmalampen, er meget højere end den laserbaserede metode. Denne stigning skyldes højtryksplasmalampens brede spektrum UV-emissionsspektrum.Ved at producere et bredt UV-spektrum overlapper højtryksplasmalampen bedre absorbansdomænet for hydrogenperoxid, hvilket resulterer i en mere effektiv produktion af hydroxylradikaler gennem fotolyse af hydrogenperoxid sammenlignet med Kr F Excimer Laser og Nd YAG Laser. Højtryksplasmalampen øger produktionen af hydroxylradikaler betydeligt ud over, hvad der typisk observeres ved hjælp af en Kr F Excimer Laser. Brug af 100 millimolarperoxid kan forårsage høje niveauer af baggrundsoxidation.Hvis proteinsystemet er modtageligt for peroxid-induceret oxidation, nedsætte koncentrationen til så lavt som 10 millimolar. HRPF's irreversible etiket giver mulighed for downstream prøve håndtering, herunder lange protease fordøjelser, kan du tilføje i tandem masse tag for multiplexing, og udføre 2D-kromatografi, alle forbedre peptid afsløring og koordinere strukturelle oplysninger.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinere våd og tør Lab Techniques Guide krystallisering af store coiled-coil indeholdende proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Ændre Baculovirus udtryk vektorer til at producere udskilles vegetabilske proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering af proteiner efter størrelse-eksklusions kromatografi koblet til multi-vinkel Light spredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

I Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet af proteininteraktioner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanopartikler System for Membran Protein-Protein Interaktion Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse af SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution og Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produktion af rekombinante PRMT-proteiner ved hjælp af Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...