Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
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Ces travaux ont été financés par l’Institut national des sciences médicales générales (R43GM125420 et R44GM125420).

1. Installation du tube capillaire
<ol><li>À l’aide d’une pierre clivante de silice, cliver 250 μm diamètre intérieur (ID) capillaire de silice à 27 pouces. Vérifiez les extrémités capillaires pour une coupe propre et droite.</li>
	<li>Créez deux fenêtres d’environ 15 mm de longueur en brûlant le revêtement en polyimide. À partir de l'«extrémité inférieure », la première fenêtre de photolyse est éloignée de 90 mm de l'«extrémité inférieure » et la deuxième fenêtre de dosimètre à 2...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

Il y a plusieurs étapes critiques pour assurer le bon étiquetage des protéines pendant toute expérience HRPF. Tout d’abord, un débit et un débit d’éclair à la source appropriés sont choisis pour s’assurer que chaque bolus de l’échantillon est irradié une fois. Cela garantit que la protéine est exposée à un seul bolus de ▪OH nouvellement formé. Une fois qu’une protéine est oxydée, la structure protéique d’ordre supérieur peut être modifiée. Pour être sûr que la structure pro...

La conformation des protéines et la structure d’ordre supérieur (HOS) associée sont les principaux déterminants de la bonne fonction biologique et du comportement aberrant1. Il en va de même pour les produits biopharmaceutiques, dont la structure et l’activité fonctionnelle dépendent de divers aspects de leur production et de leur environnement. Les changements biopharmaceutiques dans hos ont été liés aux réactions défavorables de drogue (ADR) attribuées à la pharmacologie indésirable et à la réponse immunologique patient2,3. L’apparition des ADR a alerté l’industrie biopharmaceutique sur le rôle essentiel que joue le HOS protéique dans la sécurité et l’efficacité des produits biothérapeutiques, et ils ont établi le besoin d’analyses HOS nouvelles et améliorées4.
L’empreinte des protéines radicales hydroxyles (HRPF) est une technique prometteuse pour suivre l’évolution de la protéine HOS. Hrpf implique le marquage irréversible de l’extérieur d’une protéine avec ▪OH suivi d’une analyse par spectrométrie de masse (MS) pour identifier la surface accessible au solvant de la protéine5,6,7. HRPF a été utilisé avec succès pour détecter des défauts dans la protéine HOS et sa fonction8,9,caractériser le HOS d’anticorps monoclonaux (mAb)10,11,12,13,déterminer la liaison Kd d’un ligand14,et bien plusencore 15,16,17,18,19. Une méthode courante pour générer l’OH ▪pour HRPF est l’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP), qui utilise des lasers UV rapides à haute énergie pour produire de l'▪OH à partir de la photolyse deH2O2. Pour la plupart, FPOP utilise des lasers excimer coûteux utilisant des gaz dangereux (KrF) qui exigent des garanties substantielles pour éviter les blessures respiratoires et oculaires20. Pour éviter les risques d’inhalation, d’autres ont utilisé des lasers grenat en aluminium à yttrium en néodyme quadruple de fréquence (Nd: YAG)21, qui éliminent l’utilisation de gaz toxiques mais sont toujours coûteux, nécessitent une expertise opérationnelle importante et exigent des contrôles de lumière parasite étendus pour protéger les utilisateurs contre les blessures oculaires.
Bien qu’il soit possible d’obtenir de nombreux renseignements à l’aide du HRPF, l’adoption à grande échelle dans le secteur biopharmaceutique n’a pas été respectée. Deux obstacles à l’adoption limitée du HRPF comprennent: 1) l’utilisation de lasers dangereux et coûteux qui exigent des précautions de sécurité substantielles20; et 2) l’irréprochabilité du HRPF causée par le nettoyage de fond des ▪OH qui limitent les études comparatives22. Pour supplanter l’utilisation du laser, une unité de photolyse flash plasma à haute vitesse et à haute énergie a été développée pour effectuer en toute sécurité le FPOP d’une manière facile. Pour améliorer l’irréprochabilité des expériences HRPF, une dosimétrie radicale en temps réel est mise en œuvre.
La pratique du HRPF a été limitée par l’irréprochabilité attribuée au nettoyage de fond de ▪OH22. Bien que les ▪OH soient d’excellentes sondes de la topographie des protéines, elles réagissent également avec de nombreux constituants présents dans les préparations, ce qui rend nécessaire de mesurer la concentration efficace de radical disponible pour oxyder une protéine cible. Les variations dans la préparation tampon, la concentration de peroxyde d’hydrogène, les propriétés de ligand, ou la photolyse peuvent avoir comme conséquence des différences d’oxydation entre le groupe témoin et le groupe expérimental qui créent l’ambiguïté dans des études différentielles hos. L’ajout de la dosimétrie radicale en temps réel permet l’ajustement de l’effet ▪charge OH et augmente donc la confiance et la reproductibilité lors d’une expérience HRPF. L’utilisation de la dosimétrie radicale dans le FPOP a été décrite ailleurs23,24,25,et est discutée plus en détail dans une publication récente26. Ici, nous décrivons l’utilisation d’un nouveau système de photolyse flash et dosimétrie en temps réel pour étiqueter l’apo-myoglobine équine (aMb), en comparant les niveaux d’oxydation peptidique dans une expérience FPOP à celle obtenue lors de l’utilisation d’un laser excimer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

L’empreinte des protéines du radical hydroxyle (HRPF) est une technique d’analyse structurelle d’ordre supérieur émergente et prometteuse qui fournit des informations sur les changements dans la structure des protéines, les interactions protéine-protéine ou les interactions protéine-ligand. HRPF utilise des radicaux hydroxyles(▪OH) pour étiqueter de manière irréversible la surface accessible au solvant d’une protéine. La complexité inhérente, le coût et la nature dangereuse de l’exécution du FPRH ont considérablement limité l’adoption à grande échelle dans la biopharmaceutique. Ces facteurs comprennent : 1) l’utilisation de lasers compliqués, dangereux et coûteux qui exigent des précautions de sécurité importantes; et 2) l’irréprochabilité du HRPF causée par le nettoyage de fond de ▪l’OH qui limitent les études comparatives. Cette publication fournit un protocole pour le fonctionnement d’un système HRPF sans laser. Ce système HRPF sans laser utilise une technologie d’oxydation flash de source de lumière plasma à haute énergie et à haute pression avec dosimétrie radicale en ligne. La source de lumière plasmatique est plus sûre, plus facile à utiliser et plus efficace pour générer des radicaux hydroxyles que les systèmes HRPF à base de laser, et le dosimètre radicalaire en ligne augmente la reproductibilité des études. Combiné, le système HRPF sans laser résout et surmonte les lacunes et les limites mentionnées des techniques laser.

La source de plasma à haute pression couplée à la dosimétrie en temps réel permet un meilleur contrôle de ▪rendement en OH pour observer plus précisément les changements dans la structure des protéines d’ordre supérieur. L’ajout d’adénine permet un dosimètre radicalaire efficace en temps réel. Lors de l’oxydation, l’adénine perd son absorbance UV à 265 nm(figure 2A). Le changement dans l’absorbance de l’adénine est directement lié à la concentrati...

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Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Ce protocole présente une méthode pour utiliser la dosimétrie radicale en ligne et une source de lumière plasma pour effectuer l’empreinte des protéines d’oxydation flash. Cette méthode remplace le laser UV dangereux pour simplifier et améliorer la reproductibilité de l’oxydation photochimique rapide des études de protéines.

Empreinte de protéines de radicaux hydroxyles sans laser pour effectuer une analyse structurelle d’ordre supérieur des protéines

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

L’empreinte des protéines de radical hydroxyle sans laser facilite grandement l’identification des sites d’interaction des protéines et des régions de changement de confirmation, accélérant la recherche dans les études d’agrégation, de structure et de stabilité des protéines. Avec la dosimétrie radicale en ligne, les utilisateurs peuvent ajuster la charge efficace de radicaux hydroxyles en temps réel, et avec la dosimétrie radicale en temps réel, vous pouvez économiser du temps expérimental et un échantillon précieux tout en améliorant la reproductibilité de l’étiquetage. Pour commencer, cliver un capillaire de silice de 250 micromètres de diamètre intérieur à 27 pouces avec une pierre de clivage de silice, en vérifiant les extrémités du capillaire pour une coupe propre et droite.Créez deux fenêtres d’environ 15 millimètres de longueur. À partir de l’extrémité inférieure du capillaire, brûlez le revêtement en polyimide de 90 millimètres pour créer la fenêtre de photolyse et de 225 millimètres pour la fenêtre du dosimètre. Insérez l’extrémité inférieure du capillaire juste au-delà de l’extrémité conique d’un écrou et d’une virole.Ajouter le capillaire à l’orifice cinq, serrant juste au-delà du doigt serré avec une clé. Retirez le capuchon de la cellule de photolyse du module de photolyse en le tirant directement, puis retirez le masque métallique monté magnétiquement, qui maintiendra le capillaire en place. Ouvrez la cellule du dosimètre en appuyant sur la languette à gauche et balancez la cellule du dosimètre ouverte vers la droite.Retirez les clips montés magnétiquement qui maintiendront le capillaire en place. Placez ensuite le capillaire dans le canal rainuré à la base de la cellule de photolyse, et centrez la fenêtre capillaire avec la fenêtre de la cellule de photolyse. Maintenez le capillaire en position et ajoutez le masque magnétique.Replacez le bouchon de photolyse en position. Placez le capillaire dans le canal rainuré à la base de la cellule du dosimètre et centrez la deuxième fenêtre capillaire sur la petite ouverture au centre de la cellule du dosimètre. Tout en maintenant le capillaire en position d’une main, placez les deux clips magnétiques en position pour maintenir le capillaire en place.Fermez la cellule du dosimètre jusqu’à ce qu’elle clique sur fermé. Enfin, insérez le capillaire à travers le bouton moleté au-dessus de l’ascenseur capillaire du collecteur de produit, en étendant le capillaire juste au-dessus du fond du flacon. Coupez la longueur souhaitée du tube en téflon à l’aide d’une fraise et vérifiez les extrémités pour une coupe droite propre.Insérez une extrémité de la nouvelle boucle d’injection à travers l’un des écrous et placez une nouvelle virole sur l’extrémité du tube. Maintenez l’écrou et la virole en place tout en insérant le tube dans l’orifice six de la vanne d’injection jusqu’à ce qu’il soit au fond. Serrez l’écrou avec une clé, puis confirmez que l’écrou et la virole sont solidement en place.Une fois que les deux extrémités ont un écrou et une virole fixe, vissez lâchement une extrémité à l’orifice trois et l’autre extrémité à l’orifice six. Une fois en position, serrez les deux côtés pour serrer le doigt, puis un quart de tour au-delà du doigt serré avec une clé. Allumez le système HRPF sans laser en démarrant le module fluidique, suivi du module de photolyse, du module de dosimètre, du collecteur de produit et de l’ordinateur système.Lancez le logiciel système. Submergez complètement le tube dans 10 millilitres de tampon à partir de la position de la vanne sur la pompe à seringue. Dirigez le tube de la position des déchets et le tube du port deux sur le port de seringue vers un récipient vide pour collecter les déchets.Placer des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre à la position marquée HN6 sur le carrousel collecteur du produit. Rincez la boucle d’injection cinq fois en injectant 25 microlitres d’eau de qualité HPLC avec la vanne réglée sur la position de charge. Tournez manuellement la vanne d’injection pour rincer le reste du système.Sélectionnez Traiter sur le logiciel de contrôle pour commencer à couler de l’eau jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme. Faire une solution contenant deux adénine millimolaire et 10 protéines micromolaires. Ensuite, faites une solution de trempe en utilisant 0,3 milligrammes par millilitre catalase et 35 millimolaires d’amide de méthianine.Aliquote 25 microlitres de solution de trempe dans un microtube de 200 microlitres. Diluer le peroxyde d’hydrogène à 200 millimolaires, en le maintenant sur la glace. Démarrez la tension de flash à zéro volt sur le logiciel de contrôle.Ce contrôle zéro volt déterminera toute oxydation de fond sur la protéine d’intérêt. Sélectionnez Démarrer les données AutoZero, puis Traiter puis Prêt. Enfin, tournez la vanne d’injection jusqu’à la position de charge.Placez la solution de trempe en position un sur le carrousel collecteur de produit, puis changez le flacon de produit en un sur le logiciel de contrôle du système. Immédiatement avant l’injection, mélanger 12,5 microlitres du mélange d’adénine et de protéines avec 12,5 microlitres de peroxyde d’hydrogène. Pipetter le mélange de haut en bas pour mélanger, puis le faire tourner rapidement vers le bas.Injecter 25 microlitres de cette solution en utilisant le port d’injection dans les 10 secondes suivant le mélange. Passez la vanne d’injection à la position d’injection et attendez pendant le traitement de l’échantillon. Montez la tension de flash à 750 volts sur le logiciel de contrôle et répétez les étapes d’étiquetage.Notez ensuite l’absorbance de chaque échantillon. Tout d’abord, cliquez sur Sélectionner, puis sélectionnez manuellement le début et la fin de l’absorbance maximale. Dans l’espace disponible, écrivez une description de l’exemple.Répétez cette opération pour toutes les données acquises. Copiez et collez les données dans une feuille de calcul pour calculer la variation moyenne de l’absorbance de l’adénine pour chaque tension. Une fois que tous les échantillons ont été prélevés, rincer l’orifice de la seringue et la boucle de l’échantillon en fixant la valve d’injection à la position de charge et injecter cinq fois 25 microlitres d’eau HPLC.Tournez la vanne d’injection jusqu’à la position d’injection pour rincer le reste du système avec de l’eau HPLC. Une fois rincé, arrêtez le flux, quittez le logiciel de contrôle du système et éteignez les modules, en commençant par le collecteur de produits, le module de dosimètre, le module de photolyse et enfin le module fluidique. Lors de l’oxydation, l’adénine utilisée pour la dosimétrie diminue l’absorbance UV à 265 nanomètres.Le tampon 2 contient un extracteur radicalaire, ce qui diminue le changement d’absorbance de l’adénine par rapport au tampon 1. Apomyoglobin a été modifiée en présence du peroxyde d’hydrogène et de l’adénine à quatre tensions croissantes de lampe de plasma. Six peptides ont été détectés, avec une augmentation linéaire de l’oxydation par rapport au changement de l’absorbance de l’adénine à 265 nanomètres.Ces six peptides oxydés sont marqués sur une structure cristalline de myoglobine. L’étendue de l’oxydation détectée à partir de la lampe à plasma haute pression est beaucoup plus élevée que la méthode laser. Cette augmentation provient du spectre d’émission UV à large spectre de la lampe à plasma haute pression.En produisant un large spectre UV, la lampe à plasma haute pression chevauche mieux le domaine d’absorbance du peroxyde d’hydrogène, ce qui entraîne une production plus efficace de radicaux hydroxyles grâce à la photolyse du peroxyde d’hydrogène, par rapport au laser Kr F Excimer et au laser Nd YAG. La lampe à plasma haute pression augmente considérablement la production de radicaux hydroxyles au-delà de ce qui est généralement observé à l’aide d’un laser Excimer Kr F. L’utilisation de peroxyde 100 millimolaires peut provoquer des niveaux élevés d’oxydation de fond.Si le système protéique est sensible à l’oxydation induite par le peroxyde, diminuer la concentration jusqu’à 10 millimolaires. L’étiquette irréversible de HRPF permet la manipulation des échantillons en aval, y compris les longues digestions de protéase, vous pouvez ajouter une étiquette de masse en tandem pour le multiplexage et effectuer une chromatographie 2D, améliorant ainsi la détection des peptides et la coordination des informations structurelles.

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