Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 und R44GM125420) finanziert.

1. Einbau des Kapillarrohrs
<ol><li>Mit einem Kieselsäurespaltenstein 250 μm Innendurchmesser (ID) Silica-Kapillare auf 27 Zoll spalten. Überprüfen Sie die Kapillarenden auf einen sauberen, geraden Schnitt.</li>
	<li>Erstellen Sie zwei Fenster mit einer Länge von etwa 15 mm, indem Sie die Polyimidbeschichtung verbrennen. Ausgehend vom "unteren Ende" ist das erste Photolysefenster 90 mm vom "unteren Ende" und das zweite Dosimeterfenster 225 mm vom "unteren Ende" entfernt. HINWEIS: Sobald die Beschichtung weggebr...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

Es gibt mehrere kritische Schritte, um die korrekte Markierung von Proteinen während eines HRPF-Experiments sicherzustellen. Zunächst werden eine geeignete Durchflussrate und eine geeignete Quellblitzrate ausgewählt, um sicherzustellen, dass jeder Bolus der Probe einmal bestrahlt wird. Dies stellt sicher, dass das Protein einem einzigen Bolus neu gebildeter ▪OH ausgesetzt wird. Sobald ein Protein oxidiert ist, kann die Proteinstruktur höherer Ordnung verändert werden. Um sicher zu sein, dass die native ...

Proteinkonformation und die damit verbundene Struktur höherer Ordnung (HOS) sind die Hauptdeterminanten der richtigen biologischen Funktion und des abweichenden Verhaltens1. Gleiches gilt für Biopharmazeutika, deren Struktur und funktionelle Aktivität von verschiedenen Aspekten ihrer Produktion und Umgebung abhängt. Biopharmazeutische Veränderungen in HOS wurden mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen (ADR) in Verbindung gebracht, die auf unerwünschte Pharmakologie und immunologisches Ansprechen des Patienten zurückzuführen sind2,3. Das Auftreten von ADRs hat die biopharmazeutische Industrie auf die entscheidende Rolle aufmerksam gemacht, die protein HOS für die Sicherheit und Wirksamkeit von Biotherapeutika spielt, und sie haben den Bedarf an neuen und verbesserten HOS-Analysen festgestellt4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) ist eine vielversprechende Technik, um die Veränderung des Proteins HOS zu verfolgen. HRPF beinhaltet die irreversible Markierung der Außenseite eines Proteins mit ▪OH, gefolgt von einer Massenspektrometrie (MS) -Analyse, um die lösungsmittelzugängliche Oberfläche des Proteins5,6,7zu identifizieren . HRPF wurde erfolgreich eingesetzt, um Defekte im Protein HOS und seine Funktion8,9, charakterisieren die HOS von monoklonalen Antikörpern (mAb)10,11,12,13, bestimmen die Bindung Kd eines Liganden14und vieles mehr15,16,17,18,19. Eine gängige Methode zur Erzeugung der ▪OH für HRPF ist die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP), bei der hochenergetische, schnelle UV-Laser verwendet werden,um ▪ OH aus der Photolyse vonH2O2herzustellen. In den meisten Fällen verwendet FPOP teure Excimer-Laser mit gefährlichem Gas (KrF), die erhebliche Sicherheitsvorkehrungen erfordern, um Atem- und Augenverletzungen zu vermeiden20. Um Inhalationsgefahren zu vermeiden, haben andere Frequenzvervierfachte Neodym-Yttrium-Aluminium-Granat-Laser (Nd: YAG)21verwendet, die den Einsatz von giftigen Gasen eliminieren, aber immer noch teuer sind, erhebliche Betriebskenntnisse erfordern und umfangreiche Streulichtsteuerungen erfordern, um Benutzer vor Augenverletzungen zu schützen.
Obwohl mit HRPF umfangreiche Informationen gewonnen werden können, wurde eine breite Akzeptanz in der Biopharmazie nicht erreicht. Zwei Hindernisse für die begrenzte HRPF-Einführung sind: 1) die Verwendung gefährlicher und teurer Laser, die erhebliche Sicherheitsvorkehrungen erfordern20; und 2) die Unreproduzierbarkeit von HRPF, die durch Hintergrundabfangen von ▪OH verursacht wird, die vergleichende Studieneinschränken 22. Um den Lasereinsatz zu ersetzen, wurde eine Hochgeschwindigkeits-Plasmablitz-Photolyseeinheit mit hoher Energie entwickelt, um FPOP auf einfache Weise sicher durchzuführen. Um die Irreproduzierbarkeit von HRPF-Experimenten zu verbessern, wird eine Echtzeit-Radikaldosimetrie implementiert.
Die Praxis der HRPF wurde durch die Irreproduzierbarkeit eingeschränkt, die auf die Hintergrundabfängerung von ▪OH22zurückzuführen ist. Während ▪OH ausgezeichnete Sonden der Proteintopographie sind, reagieren sie auch mit vielen Bestandteilen, die in Präparaten gefunden werden, so dass es notwendig ist, die effektive Konzentration von Radikalen zu messen, die zur Oxidation eines Zielproteins zur Verfügung stehen. Variationen in der Puffervorbereitung, Wasserstoffperoxidkonzentration, Ligandeneigenschaften oder Photolyse können zu Oxidationsunterschieden zwischen Kontroll- und Experimentellengruppen führen, die in HOS-Differentialstudien zu Mehrdeutigkeiten führen. Die Hinzufügung der Echtzeit-Radikaldosimetrie ermöglicht die Anpassung des Effekts ▪OH-Last und erhöht somit die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit während eines HRPF-Experiments. Die Verwendung der Radikaldosimetrie in FPOP wurde an anderer Stelle23,24,25beschrieben und in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung26ausführlich diskutiert. Hier beschreiben wir die Verwendung eines neuartigen Flash-Photolysesystems und einer Echtzeitdosimetrie zur Markierung von Apo-Myoglobin (aMb) von Pferden und vergleichen die Niveaus der Peptidoxidation in einem FPOP-Experiment mit denen, die bei verwendung eines Excimer-Lasers erhalten wurden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) ist eine aufstrebende und vielversprechende Strukturanalysetechnik höherer Ordnung, die Informationen über Veränderungen der Proteinstruktur, Protein-Protein-Interaktionen oder Protein-Liganden-Interaktionen liefert. HRPF verwendet Hydroxylradikale(▪OH), um die lösungsmittelzugängliche Oberfläche eines Proteins irreversibel zu kennzeichnen. Die inhärente Komplexität, die Kosten und die Gefährlichkeit der HrPF-Durchführung haben die breite Akzeptanz in der Biopharmazie erheblich eingeschränkt. Zu diesen Faktoren gehören: 1) die Verwendung komplizierter, gefährlicher und teurer Laser, die erhebliche Sicherheitsvorkehrungen erfordern; und 2) die Irreproduzierbarkeit von HRPF, die durch Hintergrundabfangen von ▪OH verursacht wird, die vergleichende Studien einschränken. Diese Veröffentlichung enthält ein Protokoll für den Betrieb eines laserfreien HRPF-Systems. Dieses laserfreie HRPF-System nutzt eine hochenergetische Hochdruck-Plasma-Lichtquellen-Blitzoxidationstechnologie mit Inline-Radikaldosimetrie. Die Plasmalichtquelle ist sicherer, einfacher zu bedienen und effizienter bei der Erzeugung von Hydroxylradikalen als laserbasierte HRPF-Systeme, und das Inline-Radikaldosimeter erhöht die Reproduzierbarkeit von Studien. In Kombination adressiert und überwindet das laserfreie HRPF-System die genannten Mängel und Grenzen laserbasierter Techniken.

Die Hochdruck-Plasmaquelle in Verbindung mit Echtzeit-Dosimetrie ermöglicht eine bessere Kontrolle ▪OH-Ausbeute, um Veränderungen in der Proteinstruktur höherer Ordnung genauer zu beobachten. Die Zugabe von Adenin ermöglicht ein effektives Echtzeit-Radikaldosimeter. Bei der Oxidation verliert Adenin die UV-Absorption bei 265 nm (Abbildung 2A). Die Änderung der Adeninabsorption steht in direktem Zusammenhang mit der Konzentration der für HRPF verfügbaren Radikale und biete...

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Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Verwendung von Inline-Radikaldosimetrie und einer Plasmalichtquelle vor, um Flash-Oxidationsprotein-Footprinting durchzuführen. Diese Methode ersetzt den gefährlichen UV-Laser, um die Reproduzierbarkeit der schnellen photochemischen Oxidation von Proteinstudien zu vereinfachen und zu verbessern.

Laserfreies Hydroxylradikalprotein-Footprinting zur Durchführung einer Strukturanalyse höherer Ordnung von Proteinen

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Laserfreies Hydroxylradikalprotein-Footprinting macht die Identifizierung von Proteininteraktionsstellen und Regionen der Bestätigungsveränderung viel einfacher und beschleunigt die Forschung in Proteinaggregations-, Struktur- und Stabilitätsstudien. Mit der Inline-Radikaldosimetrie können Benutzer die effektive Hydroxylradikalbelastung in Echtzeit einstellen, und mit der Echtzeit-Radikaldosimetrie können Sie experimentelle Zeit und wertvolle Proben sparen und gleichzeitig die Reproduzierbarkeit der Markierung verbessern. Um zu beginnen, spalten Sie eine Kieselsäurekapillar mit einem Innendurchmesser von 250 Mikrometern auf 27 Zoll mit einem Kieselsäurespaltenstein und überprüfen Sie die Enden der Kapillare auf einen sauberen und geraden Schnitt.Erstellen Sie zwei Fenster von etwa 15 Millimetern Länge. Vom unteren Ende der Kapillare brennen Sie die Polyimidbeschichtung 90 Millimeter hoch, um das Photolysefenster und 225 Millimeter für das Dosimeterfenster zu erzeugen. Setzen Sie das untere Ende der Kapillare direkt hinter dem konischen Ende einer Mutter und ferrule ein.Fügen Sie die Kapillare zu Port fünf hinzu und ziehen Sie sie mit einem Schraubenschlüssel knapp hinter dem Finger fest. Entfernen Sie die Photolyse-Zellkappe des Photolysemoduls, indem Sie sie gerade herausziehen, und entfernen Sie dann die magnetisch montierte Metallmaske, die die Kapillare an Ort und Stelle hält. Öffnen Sie die Dosimeterzelle, indem Sie auf die Lasche auf der linken Seite drücken und die Dosimeterzelle nach rechts öffnen.Entfernen Sie die magnetisch angebrachten Clips, die die Kapillare an Ort und Stelle halten. Platzieren Sie dann die Kapillare in den gerillten Kanal an der Basis der Photolysezelle und zentrieren Sie das Kapillarfenster mit dem Photolysezellfenster. Halten Sie die Kapillare in Position und fügen Sie die magnetische Maske hinzu.Setzen Sie die Photolysekappe wieder in Position. Legen Sie die Kapillare in den gerillten Kanal an der Basis der Dosimeterzelle und zentrieren Sie das zweite Kapillarfenster auf der kleinen Öffnung in der Mitte der Dosimeterzelle. Während Sie die Kapillare mit einer Hand in Position halten, platzieren Sie die beiden magnetischen Clips in Position, um die Kapillare an Ort und Stelle zu halten.Schließen Sie die Dosimeterzelle, bis sie auf Geschlossen klickt. Führen Sie schließlich die Kapillare durch den gerändelten Knopf auf dem Kapillarlift des Produktkollektors ein und verlängern Sie die Kapillare bis knapp über den Boden der Durchstechflasche. Schneiden Sie die gewünschte Länge des Teflonschlauchs mit einem Cutter und überprüfen Sie die Enden auf einen sauberen geraden Schnitt.Führen Sie ein Ende der neuen Injektionsschlaufe durch eine der Muttern ein und legen Sie eine neue Ferrule auf das Ende des Rohrs. Halten Sie die Mutter und die Ferrule an Ort und Stelle, während Sie das Rohr in Anschluss sechs des Einspritzventils einführen, bis es aus ist. Ziehen Sie die Mutter mit einem Schraubenschlüssel fest und vergewissern Sie sich dann, dass die Mutter und die Ferrule sicher an Ort und Stelle sind.Sobald beide Enden eine Mutter und eine feste Ferrule haben, schrauben Sie locker ein Ende an Port drei und das andere Ende an Port sechs. Sobald Sie in Position sind, ziehen Sie beide Seiten fest, um den Finger fest zu machen, dann drehen Sie sich ein Viertel mit einem Schraubenschlüssel an den Fingern vorbei. Schalten Sie das laserfreie HRPF-System ein, indem Sie das Fluidikmodul starten, gefolgt von dem Photolysemodul, dem Dosimetermodul, dem Produktkollektor und dem Systemcomputer.Starten Sie die Systemsoftware. Tauchen Sie den Schlauch vollständig in 10 Milliliter Puffer von der Ventilposition der Spritzenpumpe ein. Leiten Sie den Schlauch von der Abfallposition und den Schlauch von Port zwei auf dem Spritzenhafen in einen leeren Behälter, um Abfälle zu sammeln.Legen Sie 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen an die Position HN6 auf dem Produktkollektorkarussell. Spülen Sie die Injektionsschleife fünfmal aus, indem Sie 25 Mikroliter HPLC-Wasser mit dem Ventil in die Lastposition einspritzen. Drehen Sie das Einspritzventil manuell, um den Rest des Systems zu spülen.Wählen Sie in der Steuerungssoftware Prozess aus, um mit dem Fließen von Wasser zu beginnen, bis sich ein Tropfen bildet. Stellen Sie eine Lösung mit zwei millimolaren Adeninen und 10 mikromollen Proteinen vor. Dann machen Sie eine Abschrecklösung mit 0,3 Milligramm pro Milliliter Katalase und 35 Millimolarmethianinamid.Aliquot 25 Mikroliter Abschrecklösung in eine 200 Mikroliter Mikroröhre. Verdünnen Sie Wasserstoffperoxid auf 200 Millimolar und halten Sie es auf Eis. Starten Sie die Blitzspannung bei null Volt an der Steuerungssoftware.Diese Null-Volt-Kontrolle bestimmt jede Hintergrundoxidation auf dem interessierenden Protein. Wählen Sie AutoZero starten, gefolgt von Verarbeiten und dann Bereit. Drehen Sie abschließend das Einspritzventil in die Lastposition.Platzieren Sie die Abschrecklösung in Position eins auf dem Produktkollektorkarussell und wechseln Sie dann die Produktfläschchen in eine auf der Systemsteuerungssoftware. Unmittelbar vor der Injektion 12,5 Mikroliter der Adenin- und Proteinmischung mit 12,5 Mikrolitern Wasserstoffperoxid mischen. Pipetten Sie die Mischung auf und ab, um sie zu mischen, und drehen Sie sie dann schnell herunter.25 Mikroliter dieser Lösung mit dem Injektionsanschluss innerhalb von 10 Sekunden nach dem Mischen injizieren. Schalten Sie das Einspritzventil in die Injektionsposition und warten Sie, während die Probe verarbeitet wird. Drehen Sie die Blitzspannung an der Steuerungssoftware auf 750 Volt und wiederholen Sie die Beschriftungsschritte.Notieren Sie dann die Absorption jeder Probe. Klicken Sie zunächst auf Auswählen, und wählen Sie dann manuell den Anfang und das Ende der Spitzenabsorption aus. Geben Sie im verfügbaren Bereich eine Beschreibung des Beispiels ein.Wiederholen Sie dies für alle erfassten Daten. Kopieren Sie die Daten und fügen Sie sie in eine Tabelle ein, um die durchschnittliche Änderung der Adeninabsorption für jede Spannung zu berechnen. Nachdem alle Proben entnommen wurden, spülen Sie den Spritzenanschluss und die Probenschleife aus, indem Sie das Injektionsventil auf die Lastposition herunterstellen und fünfmal 25 Mikroliter HPLC-Wasser injizieren.Drehen Sie das Einspritzventil in die Einspritzposition, um den Rest des Systems mit HPLC-Wasser zu spülen. Stoppen Sie nach dem Spülen den Durchfluss, verlassen Sie die Systemsteuerungssoftware und schalten Sie die Module aus, beginnend mit dem Produktkollektor, dem Dosimetermodul, dem Photolysemodul und schließlich dem Fluidikmodul. Nach der Oxidation nimmt das für die Dosimetrie verwendete Adenin die UV-Absorption um 265 Nanometer ab.Puffer 2 enthält einen Radikalfänger, der die Änderung der Adeninaufnahme im Vergleich zu Puffer 1 verringert. Apomyoglobin wurde in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Adenin bei vier steigenden Plasmalampenspannungen modifiziert. Sechs Peptide wurden nachgewiesen, mit einem linearen Anstieg der Oxidation in Bezug auf die Änderung der Adeninabsorption bei 265 Nanometern.Diese sechs oxidierten Peptide sind auf einer Kristallstruktur von Myoglobin markiert. Das Ausmaß der Oxidation, das von der Hochdruck-Plasmalampe detektiert wird, ist viel höher als bei der laserbasierten Methode. Dieser Anstieg ergibt sich aus dem breiten UV-Emissionsspektrum der Hochdruck-Plasmalampe.Durch die Erzeugung eines breiten UV-Spektrums überlappt die Hochdruck-Plasmalampe die Absorptionsdomäne von Wasserstoffperoxid besser, was zu einer effizienteren Produktion von Hydroxylradikalen durch die Photolyse von Wasserstoffperoxid im Vergleich zum Kr F Excimer Laser und Nd YAG Laser führt. Die Hochdruck-Plasmalampe erhöht die Produktion von Hydroxylradikalen signifikant über das hinaus, was typischerweise mit einem Kr F Excimer Laser beobachtet wird. Die Verwendung von 100-Millimolarperoxid kann zu einer hohen Hintergrundoxidation führen.Wenn das Proteinsystem anfällig für peroxidinduzierte Oxidation ist, verringern Sie die Konzentration auf bis zu 10 Millimolar. Das irreversible Label von HRPF ermöglicht die nachgelagerte Probenhandhabung, einschließlich langer Proteaseaufschlüsse, Sie können Tandem-Massen-Tags für Multiplexing hinzufügen und 2D-Chromatographie durchführen, um die Peptiderkennung und die Konkoordinatenstrukturinformationen zu verbessern.

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