Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (R43GM125420 ו R44GM125420).

1. התקנת הצינור נימי
<ol><li>בעזרת אבן סחף סיליקה, cleave 250 מיקרומטר קוטר פנימי (ID) נימי סיליקה ל 27 אינץ '. בדוק את הקצוות נימי לחתוך נקי, ישר.</li>
	<li>צור שני חלונות בערך 15 מ"מ אורך על ידי שריפת ציפוי פולימיד. החל מ"הקצה התחתון" הופכים את חלון הפוצליזה הראשון ל-90 מ"מ הרחק מ"הקצה התחתון" וחלון הדוזימטר השנ...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח תיוג נכון של חלבונים במהלך כל ניסוי HRPF. ראשית, קצב זרימה מתאים וקצב הבזק מקור נבחרים כדי לוודא שכל בולוס של המדגם מוקרן פעם אחת. זה מבטיח כי החלבון נחשף בולוס יחיד של ▪החדש שנוצר OH. לאחר חמצון החלבון, ניתן לשנות את מבנה החלבון מסדר גבוה יותר. כדי להיות...

קונפורמציה של חלבונים ומבנה מסדר גבוה יותר (HOS) הם הקובעים העיקריים של תפקוד ביולוגי תקין והתנהגות חריגה1. כנ"ל לגבי biopharmaceuticals, אשר מבנה ופעילות תפקודית תלויה בהיבטים שונים של הייצור והסביבה שלהם. שינוי Biopharmaceutical ב HOS קושרו תופעות לוואי (ADR) המיוחסים פרמקולוגיה לא רצויה תגובה אימונולוגית המטופל2,3. המראה של ADRs התריע על התעשייה הביופארמה לתפקיד הקריטי כי חלבון HOS ממלא הבטיחות והיעילות של biotherapeutics, והם הקימו את הצורך ניתוח HOS חדש ומשופר4.
טביעת רגל של חלבון הידרוקסיל רדיקלי (HRPF) היא טכניקה מבטיחה למעקב אחר השינוי בחלבון HOS. HRPF כרוך תיוג בלתי הפיך של החיצוני של חלבון עם ▪OH ואחריו ניתוח ספקטרומטריית מסה (MS) כדי לזהות את פני השטח נגיש ממס של החלבון5,6,7. HRPF שימש בהצלחה לגילוי פגמים בחלבון HOS ותפקודו8,9, לאפיין את HOS של נוגדנים חד שבטיים (mAb)10,11,12,13, לקבוע את Kd מחייב של ליגנד14, ועוד הרבה יותר15,16,17,18,19. שיטה נפוצה ליצירת ▪OH עבור HRPF היא חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP), אשר משתמשת בלייזר UV מהיר ואנרגיה גבוהה כדי לייצר ▪OH מפוטוליזה של H2O2. על פי רוב, FPOP משתמש לייזרים excimer יקר העסקת גז מסוכן (KrF) הדורש אמצעי הגנה משמעותיים כדי למנוע פגיעה בדרכי הנשימה והעין20. כדי למנוע סכנות שאיפה, אחרים השתמשו בתדר מרובע ניאודימיום yttrium אלומיניום גארנט (Nd:YAG) לייזרים21, אשר מבטל את השימוש בגז רעיל אבל הם עדיין יקרים, דורשים מומחיות מבצעית משמעותית, ודורשים בקרות אור תועה נרחב כדי להגן על המשתמשים מפני פגיעה בעין.
למרות שניתן להשיג מידע רב באמצעות HRPF, אימוץ נרחב בביופארמה לא נענה. שני חסמים לאימוץ מוגבל HRPF כוללים: 1) שימוש בלייזרים מסוכנים ויקרים הדורשים אמצעי זהירות משמעותיים20; ו -2) חוסר ההתאמה של HRPF שנגרם על ידי ניקוי רקע של ▪OH המגבילים מחקרים השוואתיים22. כדי להחליף את השימוש בלייזר, במהירות גבוהה, אנרגיה גבוהה פלזמה פלאש פוטוליזה היחידה פותחה כדי לבצע בבטחה FPOP באופן קל. כדי לשפר את חוסר ההתאמה של ניסויי HRPF, דוסימטריה רדיקלית בזמן אמת מיושמת.
הנוהג של HRPF הוגבל על ידי חוסר תאימות המיוחס ניקוי רקע של ▪OH22. בעוד ▪OH הם בדיקות מצוינות של טופוגרפיה חלבון, הם גם מגיבים עם מרכיבים רבים שנמצאו בהכנות, מה שהופך אותו הכרחי כדי למדוד את הריכוז היעיל של רדיקלים זמינים כדי לחמצן חלבון היעד. וריאציות בהכנת חיץ, ריכוז מי חמצן, תכונות ליגנד, או פוטוליזה יכול לגרום הבדלי חמצון בין קבוצות בקרה וניסוי שיוצרים עמימות במחקרים דיפרנציאליים HOS. התוספת של דוזימטריה רדיקלית בזמן אמת מאפשרת התאמה של ההשפעה ▪עומס OH ולכן מגבירה את הביטחון והשחזור במהלך ניסוי HRPF. השימוש בדוזימטריה רדיקלית ב- FPOP תואר במקום אחר23,24,25, והוא נדון בפירוט בפרסום האחרון26. כאן, אנו מתארים את השימוש במערכת פוטוליזה פלאש רומן ודוזימטריה בזמן אמת כדי לתייג אפו-מיוגלובין סוסים (aMb), השוואת רמות של חמצון פפטיד בניסוי FPOP לזה של המתקבל בעת שימוש בלייזר excimer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

טביעת רגל של חלבון רדיקלי הידרוקסיל (HRPF) היא טכניקת ניתוח מבנית מתפתחת ומבטיחה מסדר גבוה יותר המספקת מידע על שינויים במבנה החלבון, אינטראקציות בין חלבונים לחלבון או אינטראקציות בין חלבונים. HRPF משתמש ברדיקלים הידרוקסיל(▪OH) כדי לתייג באופן בלתי הפיך משטח נגיש ממס של חלבון. המורכבות, העלות והאופי המסוכן הטמון בביצוע HRPF הגבילו באופן משמעותי את האימוץ הנרחב בביופארמה. גורמים אלה כוללים: 1) שימוש בלייזרים מורכבים, מסוכנים ויקרים הדורשים אמצעי זהירות משמעותיים; ו -2) חוסר ההתאמה של HRPF שנגרם על ידי ניקוי רקע של ▪OH המגבילים מחקרים השוואתיים. פרסום זה מספק פרוטוקול להפעלת מערכת HRPF נטולת לייזר. מערכת HRPF נטולת לייזר זו משתמשת בטכנולוגיית חמצון הבזק מקור פלזמה באנרגיה גבוהה ובלחץ גבוה עם דוזימטריה רדיקלית בשורה. מקור אור הפלזמה בטוח יותר, קל יותר לשימוש ויעיל יותר ביצירת רדיקלים הידרוקסיל מאשר מערכות HRPF מבוססות לייזר, והדוסימטר הרדיקלי בשורה מגביר את הרבייה של מחקרים. בשילוב, מערכת HRPF נטולת הלייזר מטפלת ומתגברת על החסרונות והמגבלות שהוזכרו בטכניקות מבוססות לייזר.

מקור הפלזמה בלחץ גבוה בשילוב עם דוזימטריה בזמן אמת מאפשר שליטה טובה יותר של ▪OH תשואה להתבונן שינויים במבנה חלבון בסדר גבוה יותר בצורה מדויקת יותר. התוספת של אדנין מאפשרת דוזימטר רדיקלי יעיל בזמן אמת. עם החמצון, אדנין מאבד ספיגת UV ב 265 ננומטר (איור 2A). השינוי בספיגת אדנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

פרוטוקול זה מציג שיטה לשימוש בדוסימטריה רדיקלית מוטבעת ומקור אור פלזמה לביצוע טביעת רגל של חלבון חמצון פלאש. שיטה זו מחליפה את לייזר UV מסוכן כדי לפשט ולשפר את הרבייה של חמצון פוטוכימי מהיר של מחקרי חלבון.

טביעת רגל של חלבון הידרוקסיל רדיקלי ללא לייזר לביצוע ניתוח מבני מסדר גבוה יותר של חלבונים

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

טביעת רגל של חלבונים רדיקליים הידרוקסיל ללא לייזר הופכת את זיהוי אתרי אינטראקציית החלבון והאזורים של שינוי אישור לקל הרבה יותר, ומאיץ את המחקר במחקרי צבירת חלבונים, מבנה ויציבות. עם דוזימטריה רדיקלית מוטבעת, משתמשים יכולים להתאים את העומס הרדיקלי הידרוקסיל יעיל בזמן אמת, ועם דוזימטריה רדיקלית בזמן אמת, אתה יכול לחסוך זמן ניסיוני מדגם יקר תוך שיפור תיוג רבייה. כדי להתחיל, בקע נימי סיליקה בקוטר פנימי 250 מיקרומטר ל 27 אינץ 'עם אבן בקע סיליקה, בדיקת הקצוות של נימי לחתוך נקי וישר.צור שני חלונות באורך של כ- 15 מ"מ. מהקצה התחתון של נימי, לשרוף את ציפוי פולימיד 90 מילימטרים עד כדי ליצור את החלון photolysis ו 225 מילימטרים עבור חלון dosimeter. הכנס את הקצה התחתון של נימי רק מעבר לקצה חרוט של אגוז פרול.מוסיפים את נימי ליציאה חמש, הידוק רק מעבר לאצבע חזק עם מפתח ברגים. הסר את כובע התא photolysis של מודול photolysis על ידי משיכת אותו ישר החוצה, ולאחר מכן להסיר את מסכת מתכת רכוב מגנטית, אשר יחזיק את נימי במקום. פתח את תא הדוזימטר על-ידי דחיפת הלשונית משמאל והנפת תא הדוזימטר פתוח לימין.הסר את הקליפים המותקנים מגנטית שיחזיקו את נימי במקום. לאחר מכן הניחו את נימי לתוך הערוץ מחורץ בבסיס תא photolysis, ומרכז את החלון נימי עם חלון תא photolysis. מחזיקים את נימי בעמדה ומוסיפים את המסכה המגנטית.הנח את מכסה הפוטוליזה בחזרה בעמדה. מניחים את נימי לתוך הערוץ החריץ בבסיס תא הדוזימטר, ומרכזים את החלון הנימי השני על הצמצם הקטן במרכז תא הדוזימטר. תוך החזקת נימי בעמדה ביד אחת, מניחים את שני הקליפים המגנטיים בעמדה להחזיק את נימי במקום.סגור את תא הדוזימטר עד שילחץ על סגור. לבסוף, הכנס את נימי דרך הידית ידית ידית על גבי להרים נימי של אספן המוצר, הרחבת נימי רק מעל החלק התחתון של הבקבוקון. חותכים את האורך הרצוי של צינורות טפלון באמצעות חותך ולבדוק את הקצוות עבור חתך ישר נקי.הכנס קצה אחד של לולאת ההזרקה החדשה דרך אחד האגוזים, ומניחים פרול חדש על קצה הצינור. החזק את האגוז ואת ferrule במקום תוך החדרת הצינור ביציאה שש של שסתום ההזרקה עד שהוא לתחתית החוצה. הדק את האגוז עם מפתח ברגים, ולאחר מכן לאשר כי האגוז ואת ferrule הם בבטחה במקום.ברגע שלשני הקצוות יש אגוז ופרולה קבועה, בורג רופף בקצה אחד ליציאה שלוש והקצה השני ליציאה שש. לאחר בעמדה, להדק את שני הצדדים לאצבע חזק, ואז רבע להפוך את האצבע בעבר חזק עם מפתח ברגים. הפעל את מערכת HRPF ללא לייזר על-ידי הפעלת מודול Fluidics, ואחריו מודול הפוטוליזה, מודול הדוזימטר, אספן המוצר ומחשב המערכת.הפעל את תוכנת המערכת. שקוע לחלוטין את הצינור לתוך 10 מיליליטר של חיץ מעמדת השסתום על משאבת המזרק. כוון את הצינור מתנוחת הפסולת ואת הצינור מנמל 2 בנמל המזרק למכל ריק לאיסוף פסולת.מניחים צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר במיקום מסומן HN6 על קרוסלה אספן המוצר. יש לשטוף את לולאת ההזרקה חמש פעמים על ידי הזרקת 25 מיקרוליטרים של מים בדרגת HPLC כאשר השסתום מוגדר לתנוחת העומס. באופן ידני להפוך את שסתום ההזרקה כדי לשטוף את שאר המערכת.בחר תהליך בתוכנת הבקרה כדי להתחיל לזרום מים עד צורות טיפה. הפוך פתרון המכיל שני אדנין מילימולאר ו 10 חלבון micromolar. ואז לעשות פתרון להרוות באמצעות 0.3 מיליגרם לכל קטלאז מיליליטר ו 35 מילימולאר מיתיאנין עמיד.Aliquot 25 מיקרוליטרים של פתרון להרוות לתוך צינור מיקרו 200 מיקרוליטר. לדלל מי חמצן ל200 מילימולאר, שמירה על הקרח. הפעל את מתח הפלאש באפס וולט בתוכנת הבקרה.בקרת אפס וולט זו תקבע כל חמצון רקע בחלבון המעניין. בחר הפעל את 'מצב אוטומטי של נתונים', ואחריו 'תהליך' ולאחר מכן 'מוכן'. לבסוף, להפוך את שסתום ההזרקה עד למצב העומס.הנח את פתרון הרווה במיקום אחד על קרוסלת אספן המוצר, ולאחר מכן שנה את בקבוקון המוצר לאחד בתוכנת בקרת המערכת. מיד לפני ההזרקה, מערבבים 12.5 מיקרוליטרים של תערובת אדנין וחלבון עם 12.5 מיקרוליטרים של מי חמצן. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כדי לערבב, ואז במהירות לסובב אותו.להזריק 25 microliters של פתרון זה באמצעות יציאת ההזרקה בתוך 10 שניות של ערבוב. החלף את שסתום ההזרקה למצב ההזרקה והמתן בזמן שהדגימה מעובדת. הגבירו את מתח ההבזק ל-750 וולט בתוכנת הבקרה וחזרו על שלבי התיוג.לאחר מכן רשום את הספיגה של כל דגימה. תחילה, לחץ על בחר ולאחר מכן בחר באופן ידני את ההתחלה והסוף של ספיגת השיא. בשטח הפנוי, כתוב בתיאור של הדוגמה.חזור על פעולה זו עבור כל הנתונים שנרכשו. העתק והדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני כדי לחשב את השינוי הממוצע בספיגת אדנין עבור כל מתח. לאחר כל הדגימות נאספו, לשטוף את יציאת המזרק ואת לולאת מדגם על ידי הגדרת שסתום ההזרקה עד למצב העומס ולהזריק 25 microliters של מים HPLC חמש פעמים.להפוך את שסתום ההזרקה עד עמדת ההזרקה כדי לשטוף את שאר המערכת עם מים HPLC. לאחר ריקון, לעצור את הזרימה, לצאת תוכנת בקרת המערכת, ולכבות את המודולים, החל אספן המוצר, מודול dosimeter, מודול פוטוליזה, ולבסוף מודול fluidics. לאחר חמצון, אדנין המשמש דוזימטריה פוחתת ספיגת UV ב 265 ננומטר.חיץ 2 מכיל נבלות קיצוניות, אשר מקטין את השינוי בספיגת אדנין לעומת Buffer 1. אפומיוגלובין שונה בנוכחות מי חמצן ואדנין בארבעה מתחי מנורת פלזמה גוברים. שישה פפטידים זוהו, עם עלייה ליניארית חמצון לגבי השינוי של ספיגת אדנין ב 265 ננומטר.ששת הפפטידים המחומצנים האלה מסומנים על מבנה גבישי של מיוגלובין. מידת החמצון שזוהתה ממנורה פלזמה בלחץ גבוה הוא הרבה יותר גבוה מאשר השיטה מבוססת לייזר. עלייה זו נובעת ספקטרום פליטת UV ספקטרום רחב של מנורת פלזמה בלחץ גבוה.על ידי הפקת ספקטרום UV רחב, מנורת פלזמה בלחץ גבוה טוב יותר חופף את תחום הספיגה של מי חמצן, וכתוצאה מכך ייצור יעיל יותר של רדיקלים הידרוקסיל באמצעות הפוטוליזה של מי חמצן, לעומת לייזר Kr F Excimer ו Nd YAG לייזר. מנורת פלזמה בלחץ גבוה מגדילה באופן משמעותי את הייצור של רדיקלים הידרוקסיל מעבר למה שנצפה בדרך כלל באמצעות לייזר Kr F Excimer. באמצעות 100 מי חמצן מילימולאר יכול לגרום לרמות גבוהות של חמצון רקע.אם מערכת החלבון רגישה חמצון הנגרמת על ידי חמצן, להקטין את הריכוז עד נמוך כמו 10 מילימולאר. התווית הבלתי הפיכה של HRPF מאפשרת טיפול במדגם במורד הזרם, כולל עיכול פרוטאז ארוך, ניתן להוסיף תג מסה דו-מושבי עבור multiplexing, ולבצע כרומטוגרפיה דו-מימדית, כל שיפור זיהוי פפטיד ומידע מבני קונקורדינציה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

ב Vivo הידרוקסיל חלבון רדיקלי מדפיס הדפסה לחקר אינטראקציות חלבונים באלבוראבאבדיטיס האלאים

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

ניתוח נתוני SEC-SAXS באמצעות פירוק ופיזור EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...