Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 e R44GM125420).

1. Installazione del tubo capillare
<ol><li>Utilizzando una pietra di scissione della silice, scindere il capillare di silice di diametro interno (ID) di 250 μm a 27 pollici. Controllare le estremità capillari per un taglio pulito e dritto.</li>
	<li>Creare due finestre di circa 15 mm di lunghezza bruciando via il rivestimento in poliimmide. Partendo dall'"estremità inferiore" si fa la prima finestra di fotolisi a 90 mm di distanza dall'"estremità inferiore" e la seconda finestra del dosimetro a 225 mm di distanza ...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

Ci sono diversi passaggi critici per garantire una corretta etichettatura delle proteine durante qualsiasi esperimento HRPF. In primo luogo, vengono selezionate una portata appropriata e una velocità di infiammamento della sorgente per assicurarsi che ogni bolo del campione sia irradiato una volta. Ciò garantisce che la proteina sia esposta a un singolo bolo di nuovo ▪OH. Una volta che una proteina viene ossidata, la struttura proteica di ordine superiore può essere alterata. Per essere sicuri che la stru...

La conformazione proteica e la struttura di ordine superiore associata (HOS) sono i principali determinanti della corretta funzione biologica e del comportamento aberrante1. Lo stesso vale per i biofarmaci, la cui struttura e attività funzionale dipendono da vari aspetti della loro produzione e del loro ambiente. Il cambiamento biofarmaceutico nell'HOS è stato collegato a reazioni avverse ai farmaci (ADR) attribuite alla farmacologia indesiderabile e alla risposta immunologicadel paziente 2,3. La comparsa di ADR ha allertato l'industria biofarmaceutica sul ruolo critico che la proteina HOS svolge nella sicurezza e nell'efficacia della bioterapia e hanno stabilito la necessità di nuove e migliorate analisi HOS4.
L'ingombro di proteine radicali idrossili (HRPF) è una tecnica promettente per tenere traccia del cambiamento nella proteina HOS. HRPF comporta l'etichettatura irreversibile dell'esterno di una proteina con ▪OH seguita da analisi di spettrometria di massa (MS) per identificare la superficie accessibile al solventedella proteina 5,6,7. HRPF è stato utilizzato con successo per rilevare difetti nella proteina HOS e la suafunzione 8,9, caratterizzano l'HOS degli anticorpi monoclonali (mAb)10,11,12,13,determinare il Kd legante di un ligando14,e molto altro15,16,17,18,19. Un metodo comune per generare il ▪OH per HRPF è l'ossidazione fotochimica veloce delle proteine (FPOP), che impiega laser UV veloci ad alta energia per produrre ▪ OH dallafotolisi di H2O2. Per la maggior parte, FPOP utilizza costosi laser ad eccimeri che impiegano gas pericoloso (KrF) che richiede garanzie sostanziali per evitare lesioni respiratorie eoculari 20. Per evitare rischi di inalazione, altri hanno utilizzato laser in alluminio al neodimio yttrium alluminio quadruplicati a frequenza (Nd:YAG)21, che eliminano l'uso di gas tossici ma sono ancora costosi, richiedono una significativa competenza operativa e richiedono ampi controlli della luce vagante per proteggere gli utenti dalle lesioni agli occhi.
Sebbene sia possibile ottenere ampie informazioni utilizzando HRPF, non è stata soddisfatta un'ampia adozione in biofarmacia. Due ostacoli per la limitata adozione dell'HRPF comprendono: 1) l'uso di laser pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezzasostanziali 20; e 2) l'irriducibilità dell'HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studicomparativi 22. Per soppiantare l'uso del laser, è stata sviluppata un'unità di fotolisi flash al plasma ad alta velocità e ad alta energia per eseguire in modo sicuro FPOP in modo semplice. Per migliorare l'irriducibilità degli esperimenti HRPF, viene implementata la dosimetria radicale in tempo reale.
La pratica dell'HRPF è stata limitata dall'irriducibilità attribuita allo scavenging di fondo ▪OH22. Mentre ▪OH sono eccellenti sonde di topografia proteica, reagiscono anche con molti costituenti trovati nei preparati, rendendo necessario misurare l'effettiva concentrazione di radicale disponibile per ossidare una proteina bersaglio. Variazioni nella preparazione del tampone, concentrazione di perossido di idrogeno, proprietà del ligando o fotolisi possono causare differenze di ossidazione tra il controllo e gruppi sperimentali che creano ambiguità negli studi differenziali HOS. L'aggiunta della dosimetria radicale in tempo reale consente la regolazione dell'effetto ▪carico OH e quindi aumenta la confidenza e la riproducibilità durante un esperimento HRPF. L'uso della dosimetria radicale nell'FPOP è stato descritto altrove23,24,25, ed è ulteriormente discusso in dettaglio in una recente pubblicazione26. Qui descriviamo l'uso di un nuovo sistema di fotolisi flash e dosimetria in tempo reale per etichettare l'apo-mioglobina equina (aMb), confrontando i livelli di ossidazione peptidica in un esperimento FPOP con quello ottenuto quando si utilizza un laser ad eccimeri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

L'impronta proteica radicale idrossile (HRPF) è una tecnica di analisi strutturale emergente e promettente di ordine superiore che fornisce informazioni sui cambiamenti nella struttura proteica, sulle interazioni proteina-proteina o sulle interazioni proteina-ligando. HRPF utilizza radicali idrossilici(▪OH) per etichettare irreversibilmente la superficie accessibile al solvente di una proteina. La complessità intrinseca, i costi e la natura pericolosa delle prestazioni hrpf hanno sostanzialmente limitato l'adozione su larga scala in biofarmacia. Questi fattori includono: 1) l'uso di laser complicati, pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezza sostanziali; e 2) l'irriducibilità dell'HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studi comparativi. Questa pubblicazione fornisce un protocollo per il funzionamento di un sistema HRPF senza laser. Questo sistema HRPF senza laser utilizza una tecnologia di ossidazione flash sorgente di luce al plasma ad alta energia e alta pressione con dosimetria radicale in linea. La sorgente luminosa al plasma è più sicura, più facile da usare e più efficiente nella generazione di radicali idrossili rispetto ai sistemi HRPF basati su laser, e il dosimetro radicale in linea aumenta la riproducibilità degli studi. Combinato, il sistema HRPF senza laser risolve e supera le carenze e i limiti menzionati delle tecniche basate su laser.

La sorgente plasmatica ad alta pressione accoppiata con la dosimetria in tempo reale consente un migliore controllo della resa di ▪OH per osservare i cambiamenti nella struttura proteica di ordine superiore in modo più accurato. L'aggiunta di adenina consente un dosimetro radicale efficace in tempo reale. Al momento dell'ossidazione, l'adenina perde assorbanza UV a 265 nm (Figura 2A). Il cambiamento nell'assorbanza dell'adenina è direttamente correlato alla concentrazione di r...

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Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Questo protocollo presenta un metodo per utilizzare la dosimetria radicale in linea e una sorgente di luce plasmatica per eseguire l'impronta proteica di ossidazione flash. Questo metodo sostituisce il pericoloso laser UV per semplificare e migliorare la riproducibilità dell'ossidazione fotochimica veloce degli studi sulle proteine.

Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

L'impronta proteica dei radicali idrossilici senza laser rende molto più semplice identificare i siti di interazione proteica e le regioni di cambiamento confermazionale, accelerando la ricerca negli studi di aggregazione, struttura e stabilità delle proteine. Con la dosimetria radicale in linea, gli utenti possono regolare il carico efficace di radicali idrossilici in tempo reale e, con la dosimetria radicale in tempo reale, è possibile risparmiare tempo sperimentale e campione prezioso migliorando al contempo la riproducibilità dell'etichettatura. Per iniziare, scindere un capillare di silice di diametro interno di 250 micrometri a 27 pollici con una pietra di taglio della silice, controllando le estremità del capillare per un taglio pulito e dritto.Creare due finestre di circa 15 millimetri di lunghezza. Dall'estremità inferiore del capillare, bruciare via il rivestimento in poliimmide 90 millimetri fino a creare la finestra di fotolisi e 225 millimetri per la finestra del dosimetro. Inserire l'estremità inferiore del capillare appena oltre l'estremità conica di un dado e di un ferrule.Aggiungere il capillare alla porta cinque, stringendo appena oltre il dito stretto con una chiave inglese. Rimuovere il cappuccio della cella di fotolisi del modulo di fotolisi tirandolo direttamente fuori, quindi rimuovere la maschera metallica montata magneticamente, che terrà il capillare in posizione. Aprire la cella del dosimetro spingendo sulla linguetta a sinistra e aprire la cella del dosimetro a destra.Rimuovere le clip montate magneticamente che tratteneranno il capillare in posizione. Quindi posizionare il capillare nel canale scanalato alla base della cella di fotolisi e centrare la finestra capillare con la finestra della cella di fotolisi. Tenere il capillare in posizione e aggiungere la maschera magnetica.Riposizionare il cappuccio della fotolisi. Posizionare il capillare nel canale scanalato alla base della cella del dosimetro e centrare la seconda finestra capillare sulla piccola apertura al centro della cella del dosimetro. Tenendo il capillare in posizione con una mano, posizionare le due clip magnetiche in posizione per mantenere il capillare in posizione.Chiudere la cella del dosimetro fino a quando non fa clic su chiuso. Infine, inserire il capillare attraverso la manopola zigrinata in cima al sollevatore capillare del collettore del prodotto, estendendo il capillare appena sopra il fondo del flaconcino. Tagliare la lunghezza desiderata dei tubi in teflon utilizzando una fresa e controllare le estremità per un taglio dritto pulito.Inserire un'estremità del nuovo ciclo di iniezione attraverso uno dei dadi e posizionare un nuovo ferrule sull'estremità del tubo. Tenere il dado e il ferrule in posizione mentre si inserisce il tubo nella porta sei della valvola di iniezione fino a quando non si es verso l'alto. Stringere il dado con una chiave inglese, quindi confermare che il dado e il ferrule sono saldamente in posizione.Una volta che entrambe le estremità hanno un dado e un ferrule fisso, avvitare liberamente un'estremità alla porta tre e l'altra estremità alla porta sei. Una volta in posizione, stringere entrambi i lati a dito stretto, quindi un quarto girare oltre il dito stretto con una chiave inglese. Accendere il sistema HRPF senza laser avviando il modulo fluidico, seguito dal modulo di fotolisi, dal modulo dosimetro, dal raccoglitore di prodotti e dal computer di sistema.Avviare il software di sistema. Immergere completamente i tubi in 10 millilitri di tampone dalla posizione della valvola sulla pompa della siringa. Dirigere i tubi dalla posizione dei rifiuti e i tubi dalla porta due sulla porta della siringa verso un contenitore vuoto per raccogliere i rifiuti.Posizionare tubi a microcentrifugo da 1,5 millilitri nella posizione contrassegnata con HN6 sul carosello del collettore di prodotto. Risciacquare il circuito di iniezione cinque volte iniettando 25 microlitri di acqua di grado HPLC con la valvola impostata sulla posizione di carico. Ruotare manualmente la valvola di iniezione per sciacquare il resto del sistema.Selezionare Processo sul software di controllo per iniziare a scorrere l'acqua fino a quando non si forma una goccia. Creare una soluzione contenente due adenine millimolare e 10 proteine micromolari. Quindi fare una soluzione di tempra usando 0,3 milligrammi per millilitro catalasi e 35 millimolare ammide di metina.Aliquot 25 microlitri di soluzione di tempra in un microtubo da 200 microlitri. Diluire il perossido di idrogeno a 200 millimolare, mantenendolo sul ghiaccio. Avviare la tensione flash a zero volt sul software di controllo.Questo controllo a volt zero determinerà qualsiasi ossidazione di fondo sulla proteina di interesse. Selezionare Avvia controllo automatico dati, seguito da Processo e quindi Pronto. Infine, abbassare la valvola di iniezione nella posizione di carico.Posizionare la soluzione di tempra in posizione uno sul carosello del collettore di prodotto, quindi cambiare il flaconcino del prodotto in uno sul software di controllo del sistema. Immediatamente prima dell'iniezione, mescolare 12,5 microlitri della miscela di adenina e proteine con 12,5 microlitri di perossido di idrogeno. Pipettare la miscela su e giù per mescolare, quindi ruotarla rapidamente verso il basso.Iniettare 25 microlitri di questa soluzione utilizzando la porta di iniezione entro 10 secondi dalla miscelazione. Passare alla valvola di iniezione nella posizione di iniezione e attendere durante l'elaborazione del campione. Alzare la tensione flash a 750 volt sul software di controllo e ripetere i passaggi di etichettatura.Quindi registrare l'assorbanza di ogni campione. Fare innanzitutto clic su Seleziona, quindi selezionare manualmente l'inizio e la fine dell'assorbanza del picco. Nello spazio disponibile scrivere in una descrizione dell'esempio.Ripeti questo per tutti i dati acquisiti. Copiare e incollare i dati in un foglio di calcolo per calcolare la variazione media dell'assorbanza dell'adenina per ogni tensione. Dopo aver raccolto tutti i campioni, sciacquare la porta della siringa e il ciclo del campione impostando la valvola di iniezione nella posizione di carico e iniettare 25 microlitri di acqua HPLC cinque volte.Ruotare la valvola di iniezione fino alla posizione di iniezione per scaricare il resto del sistema con acqua HPLC. Una volta lavato, arrestare il flusso, uscire dal software di controllo del sistema e spegnere i moduli, a partire dal raccoglitore di prodotti, dal modulo dosimetro, dal modulo di fotolisi e infine dal modulo fluidico. Dopo l'ossidazione, l'adenina utilizzata per la dosimetria diminuisce nell'assorbanza UV a 265 nanometri.Il buffer 2 contiene uno spazzino radicale, che riduce la variazione dell'assorbanza dell'adenina rispetto al Buffer 1. L'apomioglobina è stata modificata in presenza di perossido di idrogeno e adenina a quattro crescenti tensioni della lampada al plasma. Sono stati rilevati sei peptidi, con un aumento lineare dell'ossidazione rispetto al cambiamento dell'assorbanza dell'adenina a 265 nanometri.Questi sei peptidi ossidati sono etichettati su una struttura cristallina di mioglobina. L'estensione dell'ossidazione rilevata dalla lampada al plasma ad alta pressione è molto più alta del metodo basato su laser. Questo aumento deriva dall'ampio spettro di emissione UV della lampada al plasma ad alta pressione.Producendo un ampio spettro UV, la lampada al plasma ad alta pressione si sovrappone meglio al dominio di assorbanza del perossido di idrogeno, risultando in una produzione più efficiente di radicali idrossilici attraverso la fotolisi del perossido di idrogeno, rispetto al laser Kr F Excimer e al laser Nd YAG. La lampada al plasma ad alta pressione aumenta significativamente la produzione di radicali idrossilici oltre a quanto si osserva tipicamente utilizzando un laser Kr F Excimer. L'uso di perossido di 100 millimolare può causare alti livelli di ossidazione dello sfondo.Se il sistema proteico è suscettibile all'ossidazione indotta dal perossido, ridurre la concentrazione fino a 10 millimolare. L'etichetta irreversibile di HRPF consente la gestione a valle del campione, comprese le lunghe digestione della proteasi, è possibile aggiungere tag di massa tandem per il multiplexing ed eseguire la cromatografia 2D, il tutto migliorando il rilevamento peptidico e le informazioni strutturali coordinate.

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