Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

この研究は、国立一般医学研究所(R43GM125420およびR44GM125420)によって資金提供されました。

1. キャピラリーチューブの取り付け
<ol><li>シリカ切断石を使用して、250 μm 内径(ID)シリカ毛管を27インチに切断します。毛細管の端部がきれいな、まっすぐな切り傷を点検しなさい。</li>
	<li>ポリイミドコーティングを焼き払って、長さ約15mmの2つの窓を作成します。「下端」から始めて、最初の光起点窓を「下端」から90mm離れ、「下端」から225mm離れた場所に向けて行います。 注:コーテ...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

HRPF実験中にタンパク質の適切な標識を確実に行うためには、いくつかの重要なステップがあります。まず、適切な流量とソースフラッシュレートが、試料の各ボーラスが一度照射されるのを確実にするために選択される。これにより、タンパク質が新たに形成された ▪OHの単一のボーラスにさらされることが保証されます。タンパク質が酸化されると、より高次のタンパク質構造を?...

タンパク質の立体構造および関連する高次構造(HOS)は、適切な生物学的機能および異常な挙動1の主要な決定因子である。同じことが、その構造と機能活性が生産と環境の様々な側面に依存しているバイオ医薬品にも当てはまります。HOSのバイオ医薬品の変化は、望ましくない薬理学的および患者免疫学的応答2、3に起因する有害薬物反応(ADR)に関連している。ADRの出現は、タンパク質HOSがバイオ医薬品の安全性と有効性において果たす重要な役割をバイオ医薬品業界に警告し、HOS分析4を新しく改良する必要性を確立しました。
ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリント(HRPF)は、タンパク質HOSの変化を追跡する有望な技術です。HRPFは、OH▪を伴うタンパク質の外装の不可逆的な標識を伴い、続いて質量分析(MS)分析を行い、タンパク質5、6、7の溶媒アクセス可能表面を同定する。HRPFは、タンパク質HOSとその機能8、9の欠陥の検出に成功し、モノクローナル抗体(mAb)10、11、12、13のHOSを特徴付け、リガンド14の結合Kdを決定し、さらに多くの15、16、17、18、19を検出する。HRPF用の▪OHを生成する一般的な方法は、タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)であり、H2O2の光起こしから▪OHを生成するために高エネルギー、高速UVレーザーを採用している。ほとんどの場合、FPOPは、呼吸および眼の損傷を避けるために相当な保護手段を要求する危険ガス(KrF)を採用した高価なエキシマレーザーを使用する20。吸入の危険を避けるために、他の人は、有毒ガスの使用を排除するが、依然として高価であり、重要な運用上の専門知識を必要とし、目の怪我からユーザーを保護するために広範な迷子光制御を要求する周波数四足数ネオジムイットリウムアルミニウムガーネット(Nd:YAG)レーザー21を使用しています。
HRPFを用いて十分な情報を得ることができるが、バイオ医薬品の幅広い採用は満たされていない。限られたHRPFの採用のための2つの障壁は、1)実質的な安全対策20を必要とする危険で高価なレーザーの使用を含む;2)比較研究を制限する ▪OHのバックグラウンド清掃によって引き起こされるHRPFの再現性を22.レーザー使用に取って代わる高速、高エネルギープラズマフラッシュ光度ユニットは、FPOPを安全に簡単に行うために開発されました。HRPF実験の再現性を向上させるために、リアルタイムラジカルドジメトリーが実施される。
HRPFの実践は、▪OH22のバックグラウンド清掃に起因する再現性の不足によって制限されている。▪OHはタンパク質トポグラフィーの優れたプローブですが、調製物に見られる多くの成分と反応するため、標的タンパク質を酸化するために利用可能なラジカルの有効濃度を測定する必要があります。バッファー調製、過酸化水素濃度、リガンド特性、または光分解の変動は、HOS微分試験において曖昧さを生み出す対照群と実験群の間に酸化的な違いをもたらす可能性がある。リアルタイムラジカル・ドジメトリーの追加により、OH負荷▪効果の調整が可能になり、HRPF実験中の信頼性と再現性が向上します。FPOPにおけるラジカル・ドシメトリーの使用は、他の場所で説明されている23,24,25、最近の刊行26で詳しく論じられています。ここでは、新しいフラッシュ光反応系とリアルタイムの量体系を用いて、エキシマレーザーを用いた場合のFPOP実験におけるペプチド酸化のレベルを比較して、馬のアポミオグロビン(aMb)を標識する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

Hydroxylラジカルプロテインフットプリント(HRPF)は、タンパク質構造の変化、タンパク質とタンパク質の相互作用、またはタンパクリガンド相互作用に関する情報を提供する、新たな有望な高次構造解析技術です。HRPFは、ヒドロキシルラジカル(▪OH)を利用して、タンパク質の溶媒アクセス可能な表面を不可逆的に標識します。HRPFを実行する本質的な複雑さ、コスト、および危険な性質は、バイオ医薬品における広範な採用を実質的に制限しています。これらの要因には、1)実質的な安全対策を必要とする複雑で危険で高価なレーザーの使用が含まれます。2)比較研究を制限する ▪OHのバックグラウンド清掃によって引き起こされるHRPFの再現性。本書は、レーザーフリーHRPFシステムの動作プロトコルを提供します。このレーザーフリーHRPFシステムは、インラインラジカル線量測定を用いた高エネルギー、高圧プラズマ光源フラッシュ酸化技術を利用しています。プラズマ光源は、レーザーベースのHRPFシステムよりも安全で使いやすく、ヒドロキシルラジカルの生成効率が高く、インラインラジカル線量計は研究の再現性を高めます。レーザーフリーHRPFシステムを組み合わせることで、レーザーベースの技術の欠点と限界に対処し、克服します。

リアルタイムのドサイメトリーと組み合わせた高圧血漿源により、高次タンパク質構造の変化をより正確に観察するために、▪OH収量をより適切に制御できます。アデニンの添加は有効なリアルタイムラジカルのドシメータを可能にする。酸化の際、アデニンは265nmでUV吸光度を失う(図2A)。アデニン吸光度の変化は、HRPFに利用可能なラジカルの濃度に直接関係し...

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Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

このプロトコルは、インラインラジカル線測定とプラズマ光源を使用して、フラッシュ酸化タンパク質のフットプリントを実行する方法を提示する。この方法は、タンパク質研究の高速光化学酸化の再現性を簡素化し、改善するために、危険なUVレーザーを置き換えます。

レーザーフリーヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリントによるタンパク質の高次構造解析

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

レーザーフリーのヒドロキシルラジカルタンパク質のフットプリントにより、タンパク質相互作用部位および確認変化の領域の同定が容易になり、タンパク質凝集、構造、安定性の研究が加速します。インラインラジカル線量測定により、有効なヒドロキシルラジカル負荷をリアルタイムで調整でき、リアルタイムラジカル線量測定により、実験時間と貴重なサンプルを節約しながら、ラベル再現性を向上させることができます。まず、250マイクロメートルの内径シリカキャピラリーをシリカ切断石で27インチに切断し、毛細管の端部にきれいなストレートカットを確認します。長さ約15ミリの2つの窓を作成します。毛細管の下端から、ポリイミドコーティング90ミリメートルを焼き払い、線分解窓を作成し、225ミリメートルの線虫窓を作成します。ナットとフェルールの円錐の端のすぐ先に毛細管の下端を挿入します。キャピラリーをポート5に加え、レンチで指をしっかりと向こう側に締めます。光起こしモジュールの光起細胞キャップをまっすぐ引き出して取り外し、キャピラリーを所定の位置に保持する磁気的に取り付けられた金属マスクを取り外します。左側のタブを押して、ドーシメーターセルを開き、右に開いて、行量計セルをスイングします。キャピラリーを所定の位置に保持する磁気マウントクリップを取り外します。次に、毛細管を光度細胞の基部にある溝付きチャネルに配置し、毛細管のウィンドウを光度セルウィンドウで中央に配置します。キャピラリーを置き、磁気マスクを追加します。光のキャップを元の位置に戻します。線量計セルの基部にある溝付きチャネルに毛細管を配置し、2番目のキャピラリーウィンドウを線量計セルの中央にある小さな開口部の中央に配置します。片方の手でキャピラリーを所定の位置に持ち、キャピラリーを所定の位置に保持する位置に2つの磁気クリップを置きます。クリックが閉じるまで、ドーシメータ セルを閉じます。最後に、製品コレクターのキャピラリーリフトの上にナールノブを通して毛細管を挿入し、キャピラリーをバイアルの底のすぐ上まで伸ばします。カッターを使用してテフロンチューブの所望の長さをカットし、きれいなストレートカットのために端を確認します。ナットの 1 つを通して新しい射出ループの一方の端を挿入し、チューブの端に新しいフェルールを配置します。ナットとフェルールを所定の位置に保持し、チューブを注入バルブのポート6に挿入して、底を打つまで押し出します。ナットをレンチで締め、ナットとフェルールがしっかりと配置されていることを確認します。両端にナットと固定フェルールが付いたら、一方の端をポート3に緩やかにねじ込み、もう一方の端をポート6にねじ込みます。一度位置に入ったら、両側をしっかりと引き締め、4分の1がレンチで指をしっかりと回します。流体モジュールを起動してレーザーフリーHRPFシステムをオンにし、続いて光分析モジュール、量計モジュール、製品コレクター、およびシステムコンピュータを起動します。システムソフトウェアを起動します。十分にシリンジポンプのバルブ位置からバッファの10ミリリットルにチューブを沈めます。廃棄物の位置からチューブを、シリンジポートのポート2から空の容器にチューブを向け、廃棄物を収集します。製品コレクターカルーセルにHN6とマークされた位置に1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管を置きます。25マイクロリットルのHPLCグレードの水を負荷位置に設定して注入ループを5回リンスします。システムの残りの部分をフラッシュするために注入弁を手動で回します。コントロールソフトウェアで[処理]を選択して、液滴が形成されるまで水の流れを開始します。2ミリモルアデニンと10ミクロモルタンパク質を含む溶液を作ります。その後、0.3 ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルカタラーゼと 35 ミリモル メシアニン アミドを使用してクエンチ溶液を作る.200マイクロリットルマイクロチューブにクエンチ溶液のアリコート25マイクロリットル。過酸化水素を200ミリモルに希釈し、氷の上に置きます。制御ソフトウェアのゼロボルトでフラッシュ電圧を開始します。このゼロボルト制御は、対象となるタンパク質の任意のバックグラウンド酸化を決定します。[データの自動ゼロの開始] を選択し、[処理] を [準備完了] を選択します。最後に、注入弁を負荷位置まで下げて下さい。製品コレクターカルーセルの位置にクエンチ溶液を置き、製品バイアルをシステム制御ソフトウェアの1つに変更します。注入の直前に、アデニンの12.5マイクロリットルとタンパク質混合物を12.5マイクロリットルの過酸化水素と混ぜ合わせます。混合物を上下にピペットして混ぜ、すぐに回転させます。混合の10秒以内に注入ポートを使用して、この溶液の25マイクロリットルを注入します。注入弁を注入位置に切り替え、サンプルが処理されている間待ちます。制御ソフトウェアでフラッシュ電圧を750ボルトに上げ、ラベル付け手順を繰り返します。次に、各サンプルの吸光度を記録します。まず、[選択]をクリックし、ピーク吸光度の開始と終了を手動で選択します。使用可能なスペースに、サンプルの説明を書きます。取得したすべてのデータに対してこの手順を繰り返します。データをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、各電圧のアデニン吸光度の平均変化を計算します。すべてのサンプルを採取した後、注入バルブを負荷位置に下げて注射器ポートとサンプルループを洗い流し、25マイクロリットルのHPLC水を5回注入します。注入弁を注入位置まで回し、残りのシステムをHPLC水で洗い流します。フラッシュされたら、フローを停止し、システム制御ソフトウェアを終了し、製品コレクタ、ドーシメータモジュール、光起調モジュール、そして最後に流体モジュールから始めてモジュールをオフにします。酸化の際、265ナノメートルでの紫外線吸収度の減少に使用されるアデニン。緩衝液2はラジカルスカベンジャーを含有し、これは緩衝液1と比較してアデニン吸光度の変化を減少させる。アポミオグロビンは、プラズマランプ電圧を4つ上昇させると過酸化水素とアデニンの存在下で改変した。6個のペプチドが検出され、265ナノメートルにおけるアデニン吸光度の変化に対する酸化の直線的な増加を伴った。これら6つの酸化ペプチドは、ミオグロビンの結晶構造上に標識されている。高圧プラズマランプから検出される酸化の程度は、レーザーベースの方法よりもはるかに高いです。この増加は、高圧プラズマランプの広いスペクトルUV発光スペクトルから生じます。広いUVスペクトルを生成することにより、高圧プラズマランプは過酸化水素の吸光度ドメインと重なり合い、Kr FエキシマーレーザーおよびNd YAGレーザーと比較して、過酸化水素の光分解を通じてヒドロキシルラジカルのより効率的な生産をもたらす。高圧プラズマランプは、Kr Fエキシマーレーザーを用いて通常観測されるものを超えてヒドロキシルラジカルの生産を大幅に増加させます。100 ミリモル過酸化物を使用すると、高レベルのバックグラウンド酸化を引き起こす可能性があります。.タンパク質系が過酸化物酸化の影響を受けやすい場合は、濃度を10ミリモルまで低下させます。HRPFの不可逆的なラベルは、長いプロテアーゼ消化を含む下流のサンプル処理を可能にし、多重化のためのタンデムマスタグを追加し、2Dクロマトグラフィーを行い、ペプチド検出を改善し、構造情報を調整することができます。

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