Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
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이 작품은 일반 의학의 국립 연구소에 의해 투자되었다 (R43GM125420 및 R44GM125420).

1. 모세관 튜브 설치
<ol><li>실리카 갈라진 돌을 사용하여 250 μm 내경(ID) 실리카 모세관을 27인치로 크리브합니다. 모세관 끝을 확인하여 깨끗하고 직선적인 컷을 확인합니다.</li>
	<li>폴리이미드 코팅을 태워 길이가 약 15mm인 두 개의 창을 만듭니다. "하부 엔드"에서 시작하여 첫 번째 사진 석기 창을 "하부 끝"에서 90mm 떨어진 곳에 만들고 두 번째 도시계 창은 "하부 끝"에서 225mm 떨어진 곳에 있습니?...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

HRPF 실험 중에 단백질의 적절한 라벨링을 보장하기 위한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 적절한 유량 및 소스 플래시 레이트가 선택되어 시료의 각 볼러스가 한 번 조사되도록 합니다. 이것은 단백질이 새로 형성된 ▪OH의 단 하나 bolus에 드러나는 것을 보장합니다. 단백질이 산화되면, 더 높은 차순 단백질 구조를 변경할 수 있습니다. 네이티브 단백질 구조가 조사되고 있다고 확신...

단백질 형태 및 관련 고차 구조(HOS)는 적절한 생물학적 기능 및 비정상적인 동작 1의 주요결정요인이다. 구조와 기능 활동이 생산 및 환경의 다양한 측면에 의존하는 바이오 의약품도 마찬가지입니다. HOS의 바이오 의약품 변화는 바람직하지 않은 약리학 및 환자 면역 학적 반응2,3에기인하는 불리한 약물 반응 (ADR)에 연결되었습니다. ADRs의 출현은 바이오 제약 업계에 단백질 HOS가 생물 치료제의 안전성과 효능에서 중요한 역할을 하고 있으며, 새롭고 향상된 HOS 분석4의필요성을 확립했습니다.
하이드록실 라디칼 단백질 발자국(HRPF)은 단백질 HOS의 변화를 추적하는 유망한 기술입니다. HRPF는 단백질5,6,7의용매 접근 표면을 확인하기 위해 질량 분석법 (MS) 분석을 따르는 ▪OH를 가진 단백질의 외관의 돌이킬 수없는 라벨링을 포함한다. HRPF는 단백질 HOS 및 그 기능8,9에서결함을 검출하는 데 성공적으로 사용되었으며, 단일 클론 항체 (mAb)10,11,12,13의HOS를 특성화하고 리간드14의결합 Kd를 결정하고15,16,17,18,19. HRPF에 대한 ▪OH를 생성하는 일반적인 방법은 H 2O2의사진 에서 ▪OH를 생산하기 위해 고에너지, 빠른 UV 레이저를 사용하는 단백질 (FPOP)의 빠른 광화학 산화입니다. 대부분의 경우, FPOP는 호흡기 및 눈 손상을 피하기 위해 상당한 안전 장치를 요구하는 유해 가스 (KrF)를 사용하는 고가의 엑시머 레이저를사용합니다(20). 흡입 위험을 피하기 위해 다른 사람들은 독성 가스사용을 없애고 상당한 운영 전문 지식을 필요로 하며 눈 손상으로부터 사용자를 보호하기 위해 광범위한 길잃은 광 제어를 요구하는 주파수 네이드뮴 이트리움 알루미늄 가넷(Nd:YAG)레이저(21)를사용했습니다.
충분한 정보는 HRPF를 사용하여 얻을 수 있지만, 바이오 제약에서 광범위한 채택은 충족되지 않았습니다. 제한된 HRPF 채택을위한 두 가지 장벽은 다음과 같습니다 : 1) 상당한 안전 예방 조치를 요구하는 위험하고 비싼 레이저의 사용20; 및 2) 비교연구(22)를제한하는 ▪OH의 배경 청소에 의한 HRPF의 불경성. 레이저 사용을 대체하기 위해 고속, 고에너지 플라즈마 플래시 사진 용해 장치가 개발되어 FPOP를 용이하게 하는 방식으로 안전하게 수행했습니다. HRPF 실험의 불가능성을 개선하기 위해 실시간 라디칼 도시메트리가 구현됩니다.
HRPF의 관행은 ▪OH22의배경 청소에 기인하는 불경한 성에 의해 제한되었습니다. ▪OH는 단백질 지형의 우수한 프로브이지만, 그들은 또한 준비에서 발견 된 많은 성분과 반응하여 표적 단백질을 산화할 수있는 급진적 인 활성농도를 측정할 필요가 있습니다. 완충 제제, 과산화수소 농도, 리간드 특성 또는 광석의 변화는 HOS 차동 연구에서 모호성을 생성하는 대조군과 실험 군 간의 산화 차이를 초래할 수 있다. 실시간 라디칼 도시메트리를 첨가하면 OH 하중▪효과를 조정할 수 있으므로 HRPF 실험 중 신뢰와 재현성을 증가시킵니다. FPOP에서 급진적 인 dosimetry의 사용은 다른 곳에서 설명되었다23,24,25,그리고 최근 간행물 에서 자세히논의된다 26. 여기서, 우리는 새로운 플래시 사진 분석 시스템과 실시간 dosimetry의 사용을 설명하여 말 아포-묘글로빈(aMb)을 라벨링하여, FPOP 실험에서 펩티드 산화 수준을 엑시머 레이저를 사용할 때 얻은 것과 비교합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

하이드록실 라디칼 단백질 발자국(HRPF)은 단백질 구조, 단백질 단백질 상호 작용 또는 단백질 리간드 상호 작용의 변화에 대한 정보를 제공하는 신흥 및 유망한 고주 구조 분석 기술입니다. HRPF는 하이드록실 라디칼(▪ OH)을 사용하여 단백질의 용매 접근 표면을 돌이킬 수 없이 라벨을 붙입니다. HRPF 수행의 내재된 복잡성, 비용 및 위험성은 바이오 제약분야에서 광범위하게 채택되는 것을 실질적으로 제한했습니다. 이러한 요인은 다음과 같습니다 : 1) 상당한 안전 예방 조치를 요구하는 복잡하고 위험하며 비싼 레이저의 사용; 및 2) 비교 연구를 제한하는 ▪OH의 배경 청소에 의한 HRPF의 불경한. 이 간행물은 레이저가 없는 HRPF 시스템의 작동을 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 레이저 없는 HRPF 시스템은 라인 라디칼 도시트라이를 갖춘 고에너지 고압 플라즈마 광원 플래시 산화 기술을 활용합니다. 플라즈마 광원은 레이저 기반 HRPF 시스템보다 하이드록실 라디칼을 생성하는 데 더 안전하고 사용하기 쉬우며 효율적이며, 인라인 라디칼 도지미터는 연구의 재현성을 증가시킵니다. 레이저가 없는 HRPF 시스템은 레이저 기반 기술의 언급된 단점과 한계를 해결하고 극복합니다.

실시간 dosimetry와 결합된 고압 플라즈마 소스는 ▪OH 항복을 더 잘 제어하여 고차 단백질 구조의 변화를 보다 정확하게 관찰할 수 있게 합니다. 아데닌을 첨가하면 효과적인 실시간 라디칼 도지계가 가능합니다. 산화시, 아데닌은 265 nm(그림 2A)에서UV 흡광도를 잃는다. 아데닌 흡광도의 변화는 따라서 효과적으로 버퍼, 부형제, 리간드(그림 2B)와?...

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Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

이 프로토콜은 플래시 산화 단백질 발자국을 수행하기 위해 인라인 라디칼 도시메트리와 플라즈마 광원을 사용하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 단백질 연구의 빠른 광화학 산화의 재현성을 단순화하고 개선하기 위해 위험한 UV 레이저를 대체합니다.

레이저가 없는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국은 단백질의 고주 구조 분석을 수행합니다.

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

레이저가 없는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국을 통해 단백질 상호 작용 사이트와 확인 변화 영역을 훨씬 쉽게 식별할 수 있으며, 단백질 응집, 구조 및 안정성 연구에 대한 연구를 가속화합니다. 인라인 라디칼 도시메트리를 사용하면 효과적인 하이드록실 라디칼 부하를 실시간으로 조정할 수 있으며, 실시간 급진적 인 dosimetry를 사용하면 라벨링 재현성을 개선하면서 실험 시간과 귀중한 샘플을 절약 할 수 있습니다. 시작하려면 250 마이크로미터 의 내부 직경 실리카 모세관을 실리카 갈라진 돌로 27 인치로 자르고 모세관의 끝을 확인하여 깨끗하고 직선으로 자른다.약 15밀리미터 길이의 두 개의 창을 만듭니다. 모세관의 하부 끝에서, 폴리이미드 코팅을 90밀리미터까지 태워 광분해 창과 도시계 창용 225밀리미터를 만듭니다. 너트와 페룰의 원추형 끝 너머에 모세관의 하부 끝을 삽입합니다.모세관을 포트 5에 넣고 렌치로 손가락을 단단히 조이세요. 포토리시스 모듈의 포토리시스 셀 캡을 바로 꺼낸 다음 모세관을 제자리에 고정시키는 자기 장착 금속 마스크를 제거합니다. 왼쪽의 탭을 밀어 서 도시계 셀을 열고 오른쪽에 열린 도지계 셀을 스윙합니다.모세관을 제자리에 고정시키는 자기 장착 클립을 제거합니다. 그런 다음 모세관을 사진 의 기지에 있는 홈 채널에 배치하고, 모세관 창을 photolysis 세포 창으로 중앙집중합니다. 모세관을 제자리에 고정하고 마그네틱 마스크를 추가합니다.포토리시스 캡을 다시 배치합니다. 도지계 셀의 베이스에 있는 홈 채널에 모세관을 배치하고, 도시계 셀의 중앙에 있는 작은 조리개에 제2 모세관 창을 중앙에 놓습니다. 모세관을 한 손으로 제자리에 고정하는 동안 두 개의 자기 클립을 위치에 놓아 모세관을 제자리에 고정시하십시오.도지계 셀이 닫을 때까지 닫습니다. 마지막으로, 모세관을 제품 수집기의 모세관 리프트 위에 있는 크누르 노브를 통해 삽입하여 모세관을 유리병 바닥 바로 위로 확장합니다. 커터를 사용하여 테플론 튜빙의 원하는 길이를 잘라 깨끗한 직선 컷을 위해 끝을 확인합니다.너트 중 하나를 통해 새 사출 루프의 한쪽 끝을 삽입하고 튜브 의 끝에 새로운 ferrule을 배치합니다. 너트와 페룰을 제자리에 고정시키면서 튜브를 사출 밸브 의 포트 6에 삽입하여 바닥이 나올 때까지 놓습니다. 렌치로 너트를 조인 다음 너트와 ferrule이 제자리에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.양 끝이 너트와 고정 된 ferrule을 가지고 나면, 느슨하게 포트 세 포트에 한쪽 끝을 나사 다른 끝은 포트 여섯. 일단 위치에, 꽉 손가락에 양쪽을 조인 다음 분기 렌치와 꽉 손가락을 지나 집니다. 유체 모듈을 시작하여 레이저가 없는 HRPF 시스템을 켜고, 포토리미터 모듈, 제품 수집기 및 시스템 컴퓨터다음에 사용됩니다.시스템 소프트웨어를 실행합니다. 튜빙을 주사기 펌프의 밸브 위치에서 10 밀리리터의 버퍼로 완전히 담급합니다. 쓰레기통에서 튜브를 주사기 포트 2항에서 튜브를 빈 용기로 이동하여 폐기물을 수거합니다.제품 수집가 회전 목마에 HN6로 표시된 위치에 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기를 놓습니다. 하중 위치로 설정된 밸브로 HPLC 급 수의 25 마이크로리터를 주입하여 주입 루프를 5번 헹구면 주입 루프를 헹구습니다. 사출 밸브를 수동으로 돌려 시스템의 나머지 부분을 플러시합니다.제어 소프트웨어에서 프로세스를 선택하여 물방울이 형성될 때까지 물이 흐르기 시작합니다. 2개의 밀리몰라 아데닌과 10개의 마이크로몰라 단백질을 포함하는 용액을 만듭니다. 그런 다음 밀리리터 카탈라제 당 0.3 밀리그램과 35 밀리마일러 메티아닌 아마이를 사용하여 담금질 용액을 만듭니다.200 마이크로리터 마이크로 튜브에 담금질 용액의 Aliquot 25 마이크로 리터. 과산화수소를 200 밀리몰라로 희석하여 얼음 위에 보관합니다. 제어 소프트웨어의 0볼트에서 플래시 전압을 시작합니다.이 제로 볼트 제어는 관심있는 단백질에 대한 배경 산화를 결정합니다. 데이터 AutoZero 시작을 선택한 다음 프로세스를 완료합니다. 마지막으로 사출 밸브를 부하 위치로 바꿔 놓습니다.담금질 용액을 제품 수집기 회전 목마에 배치한 다음 제품 유리병을 시스템 제어 소프트웨어에서 하나로 변경합니다. 주입 직전에 아데닌의 12.5 마이크로리터와 단백질 혼합물을 과산화수소 12.5 마이크로리터와 혼합하십시오. 혼합물을 위아래로 섞은 다음 빠르게 회전합니다.혼합 후 10초 이내에 사출 포트를 사용하여 이 솔루션의 마이크로리터 25기를 주입합니다. 사출 밸브를 주입 위치로 전환하고 샘플이 처리되는 동안 기다립니다. 제어 소프트웨어에서 플래시 전압을 750볼트로 설정하고 라벨링 단계를 반복합니다.그런 다음 각 샘플의 흡광도를 기록합니다. 먼저 선택(Select)을 클릭한 다음 피크 흡광도의 시작과 끝을 수동으로 선택합니다. 사용 가능한 공간에서 샘플에 대한 설명에 적는다.획득한 모든 데이터에 대해 이 작업을 반복합니다. 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여 넣은 후 각 전압에 대한 아데닌 흡광도의 평균 변화를 계산합니다. 모든 샘플을 채취한 후, 주사 밸브를 하중 위치로 설정하여 주사기 포트 및 샘플 루프를 플러시하고 HPLC 물 25 마이크로리터를 5회 주입한다.주입 밸브를 주입 위치로 돌려 시스템의 나머지 부분을 HPLC 물로 플러시합니다. 플러시되면 흐름을 멈추고 시스템 제어 소프트웨어를 종료하고 제품 수집기, 체계 모듈, photolysis 모듈 및 마지막으로 유체 모듈로 시작하여 모듈을 끕니다. 산화 시, dosimetry에 사용 되는 아데닌에서 UV 흡광도 감소 265 나노 미터.버퍼 2에는 버퍼 1에 비해 아데닌 흡광도의 변화를 감소시키는 급진적 스캐빈거가 포함되어 있습니다. 아포묘글로빈은 과산화수소와 아데닌이 있는 상황에서 4개의 플라즈마 램프 전압을 증가시켰다. 6개의 펩타이드가 검출되었고, 265나노미터에서 아데닌 흡광도의 변화에 대하여 산화가 선형으로 증가했습니다.이 6개의 산화 펩타이드는 myoglobin의 결정 구조에 표지됩니다. 고압 플라즈마 램프로부터 검출된 산화의 정도는 레이저 기반 방법보다 훨씬 높다. 이러한 증가는 고압 플라즈마 램프의 광범위한 스펙트럼 UV 방출 스펙트럼에서 발생합니다.광범위한 UV 스펙트럼을 생성함으로써, 고압 플라즈마 램프는 과산화수소의 흡광도 영역과 더 잘 겹쳐서, Kr F 엑시머 레이저 및 Nd YAG 레이저에 비해 과산화수소의 광분해를 통해 하이드록실 라디칼의 보다 효율적인 생산을 초래한다. 고압 플라즈마 램프는 Kr F 엑시머 레이저를 사용하여 일반적으로 관찰되는 것 이상으로 하이드록실 라디칼의 생산을 크게 증가시킵니다. 과산화수소 100밀리머를 사용하면 높은 수준의 배경 산화가 발생할 수 있습니다.단백질 시스템이 과산화수소 유발 산화에 취약하다면 농도를 10 밀리머로 낮춥시다. HRPF의 돌이킬 수 없는 라벨은 긴 프로테아제 소화를 포함한 다운스트림 시료 처리를 허용하고, 멀티플렉싱을 위한 탠덤 질량 태그에 추가하고, 2D 크로마토그래피를 수행하여 펩티드 검출을 개선하고 구조적 정보를 조율할 수 있습니다.

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Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

다각형 광 산란에 결합된 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단백질의 특성 (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

체노하브디염 예쁜꼬마선충의 단백질 상호작용 연구를 위한 생체내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: 프로테오믹스의 단백질 공동 발현 클러스터링 및 네트워크 분석을 위한 간소화된 응용 프로그램

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...