Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 og R44GM125420).

1. Montering av kapillærrøret
<ol><li>Ved hjelp av en silikaklyngestein, cleave 250 μm indre diameter (ID) silika kapillær til 27 tommer. Kontroller kapillærendene for et rent, rett snitt.</li>
	<li>Lag to vinduer omtrent 15 mm lange ved å brenne bort polyimidbelegget. Fra den "nedre enden" gjør du det første fotolysevinduet 90 mm fra den "nedre enden" og det andre dosimetervinduet 225 mm fra den "nedre enden". MERK: Når belegget er brent bort, er kapillæren svært skjør.</li>
	<li>Skru av mutteren og fer...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

Det er flere kritiske trinn for å sikre riktig merking av proteiner under et HRPF-eksperiment. For det første velges en passende strømningshastighet og kildeblitshastighet for å sikre at hver bolus av prøven bestråles en gang. Dette sikrer at proteinet blir utsatt for en enkelt bolus av nydannede ▪OH. Når et protein er oksidert, kan proteinstrukturen med høyere rekkefølge endres. For å være trygg på at den opprinnelige proteinstrukturen er undersøkt, må hvert proteinmolekyl endres på et enkelt...

Proteinkonformasjon og tilhørende høyere ordensstruktur (HOS) er de viktigste determinantene for riktig biologisk funksjon og avvikende oppførsel1. Det samme gjelder biofarmasøytiske stoffer, hvis struktur og funksjonelle aktivitet er avhengig av ulike aspekter av produksjon og miljø. Biofarmasøytisk endring i HOS har vært knyttet til bivirkninger (ADR) som tilskrives uønsket farmakologi og pasientens immunologiske respons2,3. Utseendet til BIVIRKNINGER har varslet den biofarmasøytiske industrien om den kritiske rollen som protein HOS spiller i sikkerhet og effekt av bioterapeutikk, og de har etablert behovet for ny og forbedret HOS-analyse4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en lovende teknikk for å spore endringen i protein HOS. HRPF innebærer irreversibel merking av et proteins eksteriør med ▪OH etterfulgt av massespektrometri (MS) analyse for å identifisere den løsningsmiddeltilgjengelige overflaten av proteinet5,6,7. HRPF har med hell blitt brukt til å oppdage defekter i protein HOS og dens funksjon8,9, karakteriserer HOS av monoklonale antistoffer (mAb)10,11,12,13, bestemme bindingen Kd av en ligand14, og mye mer15,16,17,18,19. En vanlig metode for å generere ▪OH for HRPF er Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP), som bruker høyenergiske, raske UV-lasere for å produsere ▪OH fra fotolyse av H2O2. For det meste bruker FPOP dyre ekssitasjonslasere som bruker farlig gass (KrF) som krever betydelige sikkerhetstiltak for å unngå åndedretts- og øyeskader20. For å unngå innåndingsfarer har andre brukt frekvens firedoblet neodymium yttrium aluminiumspynt (Nd:YAG) lasere21, som eliminerer bruken av giftig gass, men som fortsatt er kostbare, krever betydelig driftskompetanse og krever omfattende bortkomne lyskontroller for å beskytte brukere mot øyeskader.
Selv om rikelig med informasjon kan innhentes ved hjelp av HRPF, er bred adopsjon i biofarma ikke oppfylt. To barrierer for begrenset HRPF-adopsjon inkluderer: 1) bruk av farlige og dyre lasere som krever betydelige sikkerhetsforanstaltninger20; og 2) irreproducibility av HRPF forårsaket av bakgrunn scavenging av ▪OH som begrenser komparative studier22. For å erstatte laserbruk ble en høyhastighets plasmablitsfotolyseenhet med høy energi utviklet for å utføre FPOP på en facile måte. For å forbedre irreproducibility av HRPF eksperimenter, sanntid radikal dosimetri er implementert.
Praktiseringen av HRPF har vært begrenset av irreproducibility tilskrives bakgrunnsoppfinnelse av ▪OH22. Mens ▪OH er gode sonder av proteintopografi, reagerer de også med mange bestanddeler som finnes i preparater, noe som gjør det nødvendig å måle den effektive konsentrasjonen av radikal tilgjengelig for å oksidere et målprotein. Variasjoner i bufferforberedelse, hydrogenperoksidkonsentrasjon, ligandegenskaper eller fotolyse kan føre til oksidasjonsforskjeller mellom kontroll og eksperimentelle grupper som skaper tvetydighet i HOS-differensialstudier. Tillegg av sanntids radikal dosimetri muliggjør justering av effekten ▪OH-belastning og øker derfor tilliten og reproduserbarheten under et HRPF-eksperiment. Bruk av radikal dosimetri i FPOP er beskrevet andre steder23,24,25, og diskuteres nærmere i en nylig publikasjon26. Her beskriver vi bruken av et nytt flash fotolysesystem og sanntids dosimetri for å merke hesteapinoglobin (aMb), og sammenligne nivåer av peptidoksidasjon i et FPOP-eksperiment med det som oppnås ved bruk av en excimer laser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en fremvoksende og lovende strukturell analyseteknikk med høyere rekkefølge som gir informasjon om endringer i proteinstruktur, proteinproteininteraksjoner eller proteinligandinteraksjoner. HRPF bruker hydroksylradikaler(▪OH) til å irreversibelt merke et proteins løsningsmiddel tilgjengelige overflate. Den iboende kompleksiteten, kostnaden og den farlige karakteren av å utføre HRPF har vesentlig begrenset bred adopsjon i biofarma. Disse faktorene inkluderer: 1) bruk av kompliserte, farlige og dyre lasere som krever betydelige sikkerhetsforanstaltninger; og 2) irreproducibility av HRPF forårsaket av bakgrunn scavenging av ▪OH som begrenser komparative studier. Denne publikasjonen inneholder en protokoll for drift av et laserfritt HRPF-system. Dette laserfrie HRPF-systemet bruker en høyenergi plasmalyskilde for høytrykksblits oksidasjonsteknologi med in-line radikal dosimetri. Plasmalyskilden er tryggere, enklere å bruke og mer effektiv i å generere hydroksylradikaler enn laserbaserte HRPF-systemer, og det in-line radikale dosimeteret øker reproduserbarheten av studier. Kombinert adresserer og overgår det laserfrie HRPF-systemet de nevnte manglene og begrensningene ved laserbaserte teknikker.

Høytrykks plasmakilden kombinert med sanntidsdosimetri gir bedre kontroll over ▪OH-utbytte for å observere endringer i høyere ordens proteinstruktur mer nøyaktig. Tilsetningen av adenin gir mulighet for et effektivt radikalt dosimeter i sanntid. Ved oksidasjon mister adenin UV-absorbans ved 265 nm (Figur 2A). Endringen i adeninabsorbering er direkte relatert til konsentrasjonen av radikalere som er tilgjengelige for HRPF, og gir dermed et middel til effektivt å overvåke en...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Denne protokollen presenterer en metode for å bruke inline radikal dosimetri og en plasma lyskilde for å utføre flash oksidasjon protein fotavtrykk. Denne metoden erstatter den farlige UV-laseren for å forenkle og forbedre reproduserbarheten av rask fotokjemisk oksidasjon av proteinstudier.

Laserfri hydroksylradikale proteinfotavtrykk for å utføre strukturell analyse av proteiner med høyere orden

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Laserfri hydroksylradikale proteinfotavtrykk gjør det mye enklere å identifisere proteininteraksjonssteder og områder med konfirmasjonsendring, noe som akselererer forskningen på proteinaggregering, struktur og stabilitetsstudier. Med innebygd radikal dosimetri kan brukerne justere den effektive hydroksylradikale belastningen i sanntid, og med radikal dosimetri i sanntid kan du spare eksperimentell tid og dyrebar prøve samtidig som du forbedrer merkingen av reproduserbarhet. Til å begynne med, hold en 250 mikrometer indre diameter silika kapillær til 27 tommer med en silikaklyngestein, og kontroller endene av kapillæren for et rent og rett kutt.Lag to vinduer med omtrent 15 millimeter lengde. Fra den nedre enden av kapillæren, brenn bort polyimidbelegget 90 millimeter opp for å lage fotolysevinduet og 225 millimeter for dosimetervinduet. Sett inn den nedre enden av kapillæren like utenfor den koniske enden av en mutter og ferrule.Legg kapillæren til port fem, stram like utenfor fingeren tett med en skiftenøkkel. Fjern fotolysecellehetten til fotolysemodulen ved å trekke den rett ut, og fjern deretter den magnetisk monterte metallmasken, som holder kapillæren på plass. Åpne dosimetercellen ved å trykke på fanen til venstre og sving dosimetercellen åpen til høyre.Fjern de magnetisk monterte klipsene som holder kapillæren på plass. Plasser deretter kapillæren i den rillede kanalen ved foten av fotolysecellen, og midtstill kapillærvinduet med fotolysecellevinduet. Hold kapillæren på plass og legg til den magnetiske masken.Sett fotolysehetten tilbake på plass. Plasser kapillæren i den rillede kanalen ved foten av dosimetercellen, og midtstill det andre kapillære vinduet på den lille blenderåpningen i midten av dosimetercellen. Mens du holder kapillæren på plass med den ene hånden, plasserer du de to magnetiske klipsene på plass for å holde kapillæren på plass.Lukk dosimetercellen til den klikker lukket. Til slutt setter du kapillæren gjennom den riflede knotten på toppen av produktoppsamlerens kapillære løft, og utvider kapillæren til like over bunnen av hetteglasset. Klipp ønsket lengde på Teflon-slangen ved hjelp av en kutter og kontroller endene for et rent rett kutt.Sett den ene enden av den nye injeksjonssløyfen gjennom en av mutterne, og legg en ny ferrule på enden av røret. Hold mutteren og ferrule på plass mens du setter røret i port seks av injeksjonsventilen til den bunner ut. Stram mutteren med en skiftenøkkel, og bekreft deretter at mutteren og ferrule er godt på plass.Når begge ender har en mutter og fast ferrule, skru løst den ene enden til port tre og den andre enden til port seks. Når du er på plass, stram begge sider til fingeren stramt, og drei deretter en kvart finger stramt med en skiftenøkkel. Slå på det laserfrie HRPF-systemet ved å starte fluidikkmodulen, etterfulgt av fotolysemodulen, dosimetermodulen, produktsamleren og systemdatamaskinen.Start systemprogramvaren. Senk slangen helt ned i 10 milliliter buffer fra ventilposisjonen på sprøytepumpen. Rett slangen fra avfallsposisjonen og slangen fra port to på sprøyteporten til en tom beholder for å samle avfall.Plasser 1,5 milliliter mikrosenterrør i den posisjonen som er merket med HN6 på produktoppsamlerkarusellen. Skyll injeksjonssløyfen fem ganger ved å injisere 25 mikroliter HPLC-vann med ventilen satt i lasteposisjon. Drei injeksjonsventilen manuelt for å skylle resten av systemet.Velg Prosess på kontrollprogramvaren for å begynne å strømme vann til en dråpe dannes. Lag en løsning som inneholder to millimolar adenin og 10 mikromolarprotein. Lag deretter en slukkeløsning ved hjelp av 0,3 milligram per milliliter catalase og 35 millimolar metanianin midt i.Aliquot 25 mikroliter slukkeløsning i et mikrorør på 200 mikroliter. Fortynn hydrogenperoksid til 200 millimolar, og hold det på is. Start blitsspenningen ved null volt på kontrollprogramvaren.Denne null voltkontrollen vil bestemme enhver bakgrunnsoksidasjon på proteinet av interesse. Velg Start data AutoZero, etterfulgt av Prosess og deretter Klar. Til slutt skrur du injeksjonsventilen ned til lasteposisjonen.Plasser slukkeløsningen i posisjon én på produktoppsamlerkarusellen, og endre deretter hetteglasset med produktet til et på systemkontrollprogramvaren. Umiddelbart før injeksjon blander du 12,5 mikroliter av adenin- og proteinblandingen med 12,5 mikroliter hydrogenperoksid. Pipette blandingen opp og ned for å blande, og spinn den deretter raskt ned.Injiser 25 mikroliter av denne oppløsningen ved hjelp av injeksjonsporten innen 10 sekunder etter blanding. Sett injeksjonsventilen i injeksjonsposisjon og vent mens prøven behandles. Skru opp blitsspenningen til 750 volt på kontrollprogramvaren, og gjenta merkingstrinnene.Registrer deretter absorbansen til hver prøve. Først klikker du Velg, og deretter velger du begynnelsen og slutten av toppabsorberingen manuelt. Skriv i en beskrivelse av eksemplet på den tilgjengelige plassen.Gjenta dette for alle innsamvede data. Kopier og lim inn dataene i et regneark for å beregne den gjennomsnittlige endringen i adeninabsorbering for hver spenning. Når alle prøvene er samlet inn, spyler du ut sprøyteporten og prøvesløyfen ved å sette injeksjonsventilen ned til lasteposisjonen og injisere 25 mikroliter HPLC-vann fem ganger.Vri injeksjonsventilen opp til injeksjonsposisjonen for å skylle resten av systemet med HPLC-vann. Når du er spylt, stopp strømmen, gå ut av systemkontrollprogramvaren og slå av modulene, og start med produktoppsamleren, dosimetermodulen, fotolysemodulen og til slutt fluidikkmodulen. Ved oksidasjon reduseres adenin som brukes til dosimetri ved UV-absorbans ved 265 nanometer.Buffer 2 inneholder en radikal scavenger, som reduserer endringen i adeninabsorbering sammenlignet med buffer 1. Apomyoglobin ble modifisert i nærvær av hydrogenperoksid og adenin ved fire økende plasmalampespenninger. Seks peptider ble påvist, med en lineær økning i oksidasjon med hensyn til endring av adeninabsorbering ved 265 nanometer.Disse seks oksiderte peptidene er merket på en krystallstruktur av myoglobin. Omfanget av oksidasjon som oppdages fra høytrykksplasmalampen er mye høyere enn den laserbaserte metoden. Denne økningen oppstår fra høytrykks plasmalampens bredspektret UV-utslippsspekter.Ved å produsere et bredt UV-spektrum overlapper høytrykksplasmalampen bedre absorberende domene for hydrogenperoksid, noe som resulterer i en mer effektiv produksjon av hydroksylradikaler gjennom fotolyse av hydrogenperoksid, sammenlignet med Kr F Excimer Laser og Nd YAG Laser. Høytrykksplasmalampen øker produksjonen av hydroksylradikaler betydelig utover det som vanligvis observeres ved hjelp av en Kr F Excimer Laser. Bruk av 100 millimolarperoksid kan forårsake høye nivåer av bakgrunnsoksidasjon.Hvis proteinsystemet er utsatt for peroksidindusert oksidasjon, reduser konsentrasjonen til så lav som 10 millimolar. HRPFs irreversible etikett gir mulighet for nedstrøms prøvehåndtering, inkludert lange protease fordøyelser, du kan legge til tandemmasse tag for multiplexing, og utføre 2D-kromatografi, alle forbedre peptiddeteksjon og konkoordinere strukturell informasjon.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinere våte og tørre lab teknikker for å lede Krystallisering av Store Coiled-spiral inneholder proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Endre Baculovirus uttrykk vektorer å produsere utskilles anlegget proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner etter størrelses-ekskludering kromatografi koblet til multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet av proteininteraksjoner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membran Nanopartikler System for membran Protein-Protein Interaksjon Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse av SEC-SAXS-data via EFA-overføring og spredning

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produksjon av rekombinante PRMT-proteiner ved hjelp av Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...