Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (R43GM125420 e R44GM125420).

1. Instalação do tubo capilar
<ol><li>Usando uma pedra de corte de sílica, corte 250 μm de diâmetro interno (ID) capilar de sílica de diâmetro para 27 polegadas. Verifique as extremidades capilares para um corte limpo e reto.</li>
	<li>Crie duas janelas com aproximadamente 15 mm de comprimento, queimando o revestimento de poliimida. A partir da "extremidade inferior" faça a primeira janela de fotolise a 90 mm de distância da "extremidade inferior" e a segunda janela dosímetro a 225 mm da "extremidade inferior...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

Existem várias etapas críticas para garantir a rotulagem adequada de proteínas durante qualquer experimento hrpf. Primeiro, uma taxa de fluxo apropriada e a taxa de flash de origem são selecionadas para garantir que cada bolus da amostra seja irradiado uma vez. Isso garante que a proteína seja exposta a um único bolus de recém-formado ▪OH. Uma vez que uma proteína é oxidada, a estrutura proteica de ordem mais alta pode ser alterada. Para ter certeza de que a estrutura proteica nativa é sondada, cad...

A conformação proteica e a estrutura de ordem superior associada (HOS) são os principais determinantes da função biológica adequada e do comportamento aberrante1. O mesmo se aplica aos biofarmacêuticos, cuja estrutura e atividade funcional dependem de vários aspectos de sua produção e ambiente. A mudança biofarmacêutica no HOS tem sido associada a reações adversas de medicamentos (ADR) atribuídas à farmacologia indesejável e à resposta imunológica do paciente2,3. O aparecimento de ADRs alertou a indústria biofarmacêutica para o papel crítico que o HOS proteico desempenha na segurança e eficácia da bioterapêutica, e eles estabeleceram a necessidade de novas e melhoradas análises hos4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) é uma técnica promissora para acompanhar a mudança no HOS proteico. O HRPF envolve a rotulagem irreversível do exterior de uma proteína com ▪OH seguido de análise de espectrometria de massa (MS) para identificar a superfície acessível solvente da proteína5,6,7. O HRPF tem sido usado com sucesso para detectar defeitos na proteína HOS e sua função8,9, caracterizar o HOS de anticorpos monoclonais (mAb)10,11,12,13, determinar a vinculação Kd de um ligante14, e muito mais15,16,17,18,19. Um método comum para gerar o ▪OH para HRPF é a Oxidação Fotoquímica Rápida de Proteínas (FPOP), que emprega lasers UV rápidos e de alta energia para produzir ▪OH a partir da fotolise de H2O2. Em sua maioria, o FPOP usa lasers excimer caros que empregam gás perigoso (KrF) que exigem salvaguardas substanciais para evitar lesões respiratórias e oculares20. Para evitar riscos de inalação, outros usaram lasers de alumínio de neodímio quadruplicado (Nd:YAG)lasers 21, que elimina o uso de gás tóxico, mas ainda são caros, exigem uma experiência operacional significativa e exigem extensos controles de luz desviadas para proteger os usuários contra lesões oculares.
Embora informações amplas possam ser obtidas por meio do HRPF, a ampla adoção na biopharma não foi atendida. Duas barreiras para a adoção limitada do HRPF incluem: 1) o uso de lasers perigosos e caros que exigem precauções de segurança substanciais20; e 2) a irreprodutibilidade do HRPF causada pela limpeza de fundo de ▪OH que limitam estudos comparativos22. Para suplantar o uso de laser, uma unidade de fotolise flash de plasma de alta velocidade e alta energia foi desenvolvida para realizar o FPOP com segurança de forma fácil. Para melhorar a irreprodutividade dos experimentos do HRPF, a dosimetria radical em tempo real é implementada.
A prática do HRPF tem sido limitada pela irreprodutividade atribuída à limpeza de fundo de ▪OH22. Embora ▪OH sejam excelentes sondas de topografia proteica, elas também reagem com muitos constituintes encontrados nas preparações, tornando necessário medir a concentração efetiva de radicais disponíveis para oxidar uma proteína alvo. Variações na preparação de tampão, concentração de peróxido de hidrogênio, propriedades de ligante ou fotolise podem resultar em diferenças de oxidação entre o controle e grupos experimentais que criam ambiguidade em estudos diferenciais de HOS. A adição de dosimetria radical em tempo real permite o ajuste do efeito ▪carga OH e, portanto, aumenta a confiança e a reprodutibilidade durante um experimento de HRPF. O uso da dosimetria radical no FPOP foi descrito em outros lugares23,24,25, e é ainda discutido em detalhes em uma publicação recente26. Aqui, descrevemos o uso de um novo sistema de fotolise flash e dosimetria em tempo real para rotular apo-mioglobina equina (aMb), comparando níveis de oxidação de peptídeos em um experimento FPOP ao obtido ao usar um laser excimer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) é uma técnica emergente e promissora de análise estrutural de ordem superior que fornece informações sobre mudanças na estrutura proteica, interações proteína-proteína ou interações proteína-ligand. O HRPF utiliza radicais hidroxil(▪OH) para rotular irreversivelmente a superfície acessível de solvente de uma proteína. A complexidade inerente, o custo e a natureza perigosa do desempenho do HRPF limitaram substancialmente a adoção ampla na biopharma. Esses fatores incluem: 1) o uso de lasers complicados, perigosos e caros que exigem precauções substanciais de segurança; e 2) a irreprodutibilidade do HRPF causada pela limpeza de fundo de ▪OH que limitam estudos comparativos. Esta publicação fornece um protocolo para o funcionamento de um sistema HRPF sem laser. Este sistema HRPF sem laser utiliza uma tecnologia de oxidação de flash de fonte de luz de plasma de alta energia e alta pressão com dosimetria radical em linha. A fonte de luz plasmática é mais segura, fácil de usar e mais eficiente na geração de radicais hidroxílicos do que os sistemas HRPF baseados em laser, e o dosímetro radical em linha aumenta a reprodutibilidade dos estudos. Combinado, o sistema HRPF sem laser aborda e supera as deficiências e limitações mencionadas das técnicas baseadas em laser.

A fonte de plasma de alta pressão juntamente com a dosimetria em tempo real permite um melhor controle do▪ o rendimento de OH para observar mudanças na estrutura proteica de alta ordem com mais precisão. A adição de adenina permite um dosímetro radical eficaz em tempo real. Após a oxidação, a adenina perde a absorvância UV a 265 nm(Figura 2A). A mudança na absorção de adenina está diretamente relacionada à concentração de radicais disponíveis para o HRPF, forne...

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Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Este protocolo apresenta um método para usar a dosimetria radical inline e uma fonte de luz plasmática para realizar a pegada de proteína de oxidação flash. Este método substitui o perigoso laser UV para simplificar e melhorar a reprodutibilidade da oxidação fotoquímica rápida de estudos proteicos.

Pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para realizar análises estruturais de proteínas de ordem superior

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

A pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser facilita muito a identificação de locais de interação proteica e regiões de mudanças confirmacionais, acelerando a pesquisa em estudos de agregação, estrutura e estabilidade de proteínas. Com a dosimetria radical inline, os usuários podem ajustar a carga radical de hidroxíl eficaz em tempo real, e com a dosimetria radical em tempo real, você pode economizar tempo experimental e amostra preciosa enquanto melhora a reprodutibilidade de rotulagem. Para começar, corte uma capilar de sílica de 250 micrômetros de diâmetro interno até 27 polegadas com uma pedra de fissura de sílica, verificando as extremidades do capilar para um corte limpo e reto.Crie duas janelas de aproximadamente 15 milímetros de comprimento. Da extremidade inferior do capilar, queime o revestimento de poliimida 90 milímetros para criar a janela de fotolise e 225 milímetros para a janela dosímetro. Insira a extremidade inferior do capilar logo após a extremidade cônica de uma porca e ferrule.Adicione o capilar à porta cinco, apertando um pouco além do dedo apertado com uma chave inglesa. Remova a tampa celular fotolise do módulo fotolise puxando-a diretamente para fora, em seguida, remova a máscara metálica montada magneticamente, que manterá o capilar no lugar. Abra a célula dosímetro empurrando a aba à esquerda e gire a célula dosímetro aberta para a direita.Remova os clipes magneticamente montados que manterão o capilar no lugar. Em seguida, coloque o capilar no canal ranhurado na base da célula fotolise e centralize a janela capilar com a janela da célula fotolíase. Mantenha o capilar em posição e adicione a máscara magnética.Coloque o boné de fotolise de volta na posição. Coloque o capilar no canal ranhurado na base da célula dosímetro, e centralize a segunda janela capilar na pequena abertura no centro da célula dosímetro. Enquanto segura o capilar em posição com uma mão, coloque os dois clipes magnéticos em posição para manter o capilar no lugar.Feche a célula dosímetro até que ela clique fechada. Por fim, insira o capilar através do botão amassado sobre o elevador capilar do coletor do produto, estendendo o capilar até um pouco acima da parte inferior do frasco. Corte o comprimento desejado da tubulação Teflon usando um cortador e verifique as extremidades para um corte reto limpo.Insira uma extremidade do novo laço de injeção através de uma das porcas, e coloque uma nova ferrule na extremidade do tubo. Segure a porca e a ferrula no lugar enquanto insere o tubo na porta seis da válvula de injeção até que ele se desnúde. Aperte a porca com uma chave inglesa e confirme que a porca e a ferrula estão no lugar.Uma vez que ambas as extremidades tenham uma porca e ferrule fixa, enrosque vagamente uma extremidade para a porta três e a outra extremidade para a porta seis. Uma vez em posição, aperte ambos os lados para o dedo apertado, em seguida, um quarto vire o dedo apertado com uma chave inglesa. Ligue o sistema HRPF sem laser iniciando o módulo fluido, seguido do módulo de fotolise, módulo dosímetro, coletor de produtos e computador do sistema.Inicie o software do sistema. Submergir totalmente a tubulação em 10 mililitros de tampão da posição da válvula na bomba de seringa. Direcione a tubulação da posição de resíduo e a tubulação da porta dois na porta da seringa para um recipiente vazio para coletar resíduos.Coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro na posição marcada HN6 no carrossel coletor de produtos. Enxágüe o laço de injeção cinco vezes injetando 25 microliters de água de grau HPLC com a válvula definida na posição de carga. Gire manualmente a válvula de injeção para lavar o resto do sistema.Selecione Processo no software de controle para começar a fluir água até que uma gota se forme. Faça uma solução contendo duas adenina milimães e 10 proteínas micromolar. Em seguida, faça uma solução de saciar usando 0,3 miligramas por catalase mililitro e 35 milimolars de methianina amida.Aliquot 25 microliters de solução de saciar em um micro tubo de 200 microliteres. Diluir peróxido de hidrogênio para 200 mililitros, mantendo-o no gelo. Inicie a tensão flash a zero volts no software de controle.Este controle de volts zero determinará qualquer oxidação de fundo na proteína de interesse. Selecione Iniciar dados AutoZero, seguido por Process then Ready. Por fim, vire a válvula de injeção para a posição de carga.Coloque a solução de saciar na posição um no carrossel coletor de produtos e, em seguida, altere o frasco do produto para um no software de controle do sistema. Imediatamente antes da injeção, misture 12,5 microliters da mistura de adenina e proteína com 12,5 microliters de peróxido de hidrogênio. Pipeta a mistura para cima e para baixo para misturar, em seguida, rapidamente gire-a para baixo.Injete 25 microliters desta solução usando a porta de injeção dentro de 10 segundos após a mistura. Mude a válvula de injeção para a posição de injeção e espere enquanto a amostra está sendo processada. Apareçam a tensão de flash para 750 volts no software de controle e repita as etapas de rotulagem.Em seguida, registo a absorvância de cada amostra. Primeiro, clique em Selecionar e selecione manualmente o início e o fim do pico de absorção. No espaço disponível, escreva em uma descrição da amostra.Repita isso para todos os dados adquiridos. Copie e cole os dados em uma planilha para calcular a variação média da absorvância de adenina para cada tensão. Depois de todas as amostras terem sido coletadas, limpe a porta da seringa e o laço amostral, colocando a válvula de injeção na posição de carga e injete cinco vezes microliters de água HPLC.Gire a válvula de injeção até a posição de injeção para lavar o resto do sistema com água HPLC. Uma vez lavado, pare o fluxo, saia do software de controle do sistema e desligue os módulos, começando pelo coletor de produtos, módulo dosímetro, módulo de fotolise e, finalmente, o módulo fluido. Após a oxidação, a adenina utilizada para a dosimetria diminui na absorção uv a 265 nanômetros.O Buffer 2 contém um carniceiro radical, que diminui a mudança na absorção de adenina em comparação com o Buffer 1. A apomyoglobina foi modificada na presença de peróxido de hidrogênio e adenina em quatro tensões crescentes de lâmpadas de plasma. Foram detectados seis peptídeos, com aumento linear da oxidação em relação à mudança da absorção de adenina em 265 nanômetros.Estes seis peptídeos oxidados são rotulados em uma estrutura cristalina de mioglobina. A extensão da oxidação detectada a partir da lâmpada de plasma de alta pressão é muito maior do que o método baseado em laser. Esse aumento decorre do amplo espectro de emissão UV da lâmpada de plasma de alta pressão.Ao produzir um amplo espectro UV, a lâmpada plasmática de alta pressão se sobrepõe melhor ao domínio de absorção de peróxido de hidrogênio, resultando em uma produção mais eficiente de radicais hidroxil através da fotolise do peróxido de hidrogênio, em comparação com o Kr F Excimer Laser e Nd YAG Laser. A lâmpada de plasma de alta pressão aumenta significativamente a produção de radicais hidroxil além do que é normalmente observado usando um Laser Kr F Excimer. O uso de peróxido de 100 milimônios pode causar altos níveis de oxidação de fundo.Se o sistema proteico é suscetível à oxidação induzida por peróxido, diminua a concentração para até 10 mililitros. O rótulo irreversível do HRPF permite o manuseio de amostras a jusante, incluindo digestões longas de protease, você pode adicionar em conjunto etiqueta de massa para multiplexação, e realizar cromatografia 2D, todas melhorando a detecção de peptídeos e informações estruturais concoordenadas.

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