Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Эта работа финансировалась Национальным институтом общих медицинских наук (R43GM125420 и R44GM125420).

1. Установка капиллярной трубки
<ol><li>Используя кремнеземный расщепляющий камень, расщепление капилляра кремнезема внутреннего диаметра (ID) до 27 дюймов. Проверьте концы капилляров на наличие чистого, прямого разреза.</li>
	<li>Создайте два окна длиной примерно 15 мм, сжег полиимидное покрыт?...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

Существует несколько критических шагов для обеспечения правильной маркировки белков во время любого эксперимента HRPF. Во-первых, выбирается соответствующая скорость потока и скорость вспышки источника, чтобы убедиться, что каждый болюс образца облучается один раз. Это гарантирует, чт?...

Конформация белка и связанная с ней структура высшего порядка (HOS) являются основными детерминантами правильной биологической функции и аберрантного поведения1. То же самое относится и к биофармацевтическим препаратам, структура и функциональная активность которых зависит от различных аспектов их производства и среды. Биофармацевтические изменения в ХОС были связаны с побочными лекарственными реакциями (ADR), приписываемыми нежелательной фармакологии и иммунологическому ответу пациента2,3. Появление АДР предупредило биофармацевтическую промышленность о критической роли, которую белок HOS играет в безопасности и эффективности биотерапевтических средств, и они установили необходимость в новой и улучшенной аналитике HOS4.
Гидроксилрадикалирование белка (HRPF) является перспективным методом отслеживания изменения белка HOS. HRPF включает необратимую маркировку внешней стороны белка с ▪OH с последующим масс-спектрометрическим (MS) анализом для идентификации доступной растворителю поверхности белка5,6,7. HRPF успешно применяется для выявления дефектов белка HOS и его функции8,9,характеризуют HOS моноклональных антител (mAb)10,11,12,13,определяют связывание Kd с лигандом14и более15,16,17,18,19. Распространенным методом генерации ▪OH для HRPF является быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP), в котором используются высокоэнергетические, быстрые УФ-лазеры для получения ▪OH из фотолиза H2O2. По большей части, FPOP использует дорогие эксимерные лазеры, использующие опасный газ (KrF), который требует существенных гарантий, чтобы избежать травм дыхания и глаз20. Чтобы избежать опасности вдыхания, другие использовали частотные четырехкратные лазеры21из неодима иттрия алюминиевого граната (Nd: YAG), которые исключают использование токсичного газа, но по-прежнему являются дорогостоящими, требуют значительных эксплуатационных знаний и требуют обширных элементов управления рассеянным светом для защиты пользователей от травм глаз.
Хотя с помощью HRPF можно получить обширную информацию, широкое распространение в биофармацевтической отрасли не было достигнуто. Два барьера для ограниченного принятия HRPF включают: 1) использование опасных и дорогих лазеров, которые требуют существенных мер предосторожности20; и 2) невоспроизводимость HRPF, вызванная фоновой засорением ▪ОН, которые ограничивают сравнительные исследования22. Чтобы вытеснить использование лазера, была разработана высокоскоростная высокоэнергетическая установка фотолиза плазменной вспышки для безопасного выполнения FPOP в легкой манере. Для повышения невоспроизводимости экспериментов HRPF внедрена радикальная дозиметрия в реальном времени.
Практика ППЧ была ограничена невоспроизводимостью, приписываемой фоновому мусору ▪OH22. Хотя ▪ОН являются отличными зондами топографии белка, они также реагируют со многими компонентами, обнаруженными в препаратах, что делает необходимым измерение эффективной концентрации радикала, доступного для окисления целевого белка. Изменения в буферном препарате, концентрации перекиси водорода, свойствах лигандов или фотолизе могут привести к различиям в окислении между контрольной и экспериментальной группами, которые создают неопределенность в дифференциальных исследованиях HOS. Добавление радикальной дозиметрии в реальном времени позволяет регулировать эффект ▪нагрузки ОН и, следовательно, повышает уверенность и воспроизводимость во время эксперимента HRPF. Использование радикальной дозиметрии в FPOP было описано в другом месте23,24,25и подробно обсуждается в недавней публикации26. Здесь мы описываем использование новой системы фотолиза со вспышкой и дозиметрии в реальном времени для маркировки апомиоглобина лошадей (aMb), сравнивая уровни окисления пептидов в эксперименте FPOP с уровнями, полученными при использовании эксимерного лазера.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

Гидроксилрадикалящий белковый след (HRPF) является новым и перспективным методом структурного анализа более высокого порядка, который предоставляет информацию об изменениях в структуре белка, белково-белковых взаимодействиях или белково-лигандных взаимодействиях. HRPF использует гидроксильные радикалы(▪ОН) для необратимой маркировки поверхности белка, доступной для растворителя. Сложность, стоимость и опасный характер выполнения HRPF существенно ограничили широкое внедрение в биофармацевтических системах. К таким факторам относятся: 1) использование сложных, опасных и дорогостоящих лазеров, требующих существенных мер предосторожности; и 2) невоспроизводимость HRPF, вызванная фоновой засоряющей ▪ОН, которые ограничивают сравнительные исследования. Данная публикация содержит протокол работы системы HRPF без лазера. Эта безлазерная система HRPF использует высокоэнергетическую технологию окисления плазменного источника света высокого давления с поточной радикальной дозиметрией. Плазменный источник света безопаснее, проще в использовании и более эффективен в генерации гидроксильных радикалов, чем лазерные системы HRPF, а поточный радикальный дозиметр повышает воспроизводимость исследований. В совокупности система HRPF без лазера устраняет и преодолевает упомянутые недостатки и ограничения лазерных методов.

Плазменный источник высокого давления в сочетании с дозиметрией в реальном времени позволяет лучше контролировать выход ▪OH, чтобы более точно наблюдать изменения в структуре белка более высокого порядка. Добавление аденина позволяет создать эффективный радикальный дозиметр в...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Этот протокол представляет собой метод использования встроенной радикальной дозиметрии и плазменного источника света для выполнения флеш-окисления белка. Этот метод заменяет опасный УФ-лазер для упрощения и улучшения воспроизводимости быстрого фотохимического окисления белковых исследований.

Лазерный гидроксилрадикал белковый след для выполнения структурного анализа белков более высокого порядка

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Лазерное воздействие гидроксильных радикалов на белок значительно облегчает идентификацию участков белкового взаимодействия и областей подтверждающих изменений, ускоряя исследования в исследованиях агрегации, структуры и стабильности белка. С помощью встроенной радикальной дозиметрии пользователи могут регулировать эффективную гидроксильную радикальную нагрузку в режиме реального времени, а с помощью радикальной дозиметрии в реальном времени вы можете сэкономить экспериментальное время и драгоценный образец, одновременно улучшая воспроизводимость маркировки. Для начала расщеплите капилляр кремнезема внутреннего диаметра 250 микрометров до 27 дюймов с помощью камня, расщепляющего кремнезем, проверяя концы капилляра для чистого и прямого среза.Создайте два окна длиной примерно 15 миллиметров. От нижнего конца капилляра сожгите полиимидное покрытие на 90 миллиметров вверх, чтобы создать окно фотолиза и 225 миллиметров для окна дозиметра. Вставьте нижний конец капилляра сразу за коническим концом гайки и наконечника.Добавьте капилляр к пятому порту, затягивая сразу за пальцем гаечный ключ. Снимите крышку фотолизной ячейки модуля фотолиза, вытащив ее прямо, затем снимите магнитно установленную металлическую маску, которая будет удерживать капилляр на месте. Откройте ячейку дозиметра, нажав на выступ слева, и покачайте ячейку дозиметра открытой вправо.Снимите магнитные зажимы, которые будут удерживать капилляр на месте. Затем поместите капилляр в рифленый канал у основания фотолизной ячейки и центрировать капиллярное окно с окном ячейки фотолиза. Удерживайте капилляр в положении и добавьте магнитную маску.Верните колпачок фотолиза обратно в положение. Поместите капилляр в рифленый канал у основания дозиметрической ячейки и центрите второе капиллярное окно на небольшом отверстии в центре ячейки дозиметра. Удерживая капилляр в нужном положении одной рукой, поместите два магнитных зажима в положение, чтобы удерживать капилляр на месте.Закройте ячейку дозиметра до щелчка мышью. Наконец, вставьте капилляр через накатную ручку поверх капиллярного подъемника коллектора продукта, расширяя капилляр чуть выше дна флакона. Отрежьте нужную длину тефлоновой трубки с помощью фрезы и проверьте концы на наличие чистого прямого среза.Вставьте один конец новой петли впрыска через одну из гаек и поместите новый наконечник на конец трубки. Держите гайку и наконечник на месте, вставляя трубку в шестой порт инжекционного клапана, пока он не вылетит на дно. Затяните гайку гаечный ключ, затем убедитесь, что гайка и наконечник надежно на месте.Как только оба конца имеют гайку и фиксированный наконечник, свободно прикрутите один конец к третьему порту, а другой конец к шестому порту. Оказавшись в положении, затяните обе стороны до плотного пальца, затем на четверть поверните мимо пальца тугой с помощью ключа. Включите систему HRPF без лазера, запустив модуль флюидиики, за которым следуют модуль фотолиза, модуль дозиметра, коллектор продукта и системный компьютер.Запустите системное программное обеспечение. Полностью погружите трубку в 10 миллилитров буфера из положения клапана на шприцевом насосе. Направьте трубку из положения отходов, а трубку из второго порта на шприцевом порту в пустой контейнер для сбора отходов.Поместите 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки в положение с маркировкой HN6 на карусели коллектора продукта. Промывайте инжекторную петлю пять раз, впрыскивая 25 микролитров воды класса ВЭЖХ с клапаном, установленным в положение нагрузки. Вручную поверните инжекторный клапан, чтобы промыть остальную часть системы.Выберите Процесс в управляющем программном обеспечении, чтобы начать течь воду до тех пор, пока не образуется капля. Делают раствор, содержащий два миллимоляра аденина и 10 микромолярный белок. Затем делают раствор для закалки, используя 0,3 миллиграмма на миллилитр каталазы и 35 миллимоляров метианинамида.Aliquot 25 микролитров раствора для закалки в микротрубку 200 микролитров. Разбавить перекись водорода до 200 миллимолар, сохранив ее на льду. Запустите напряжение вспышки при нулевых вольтах на управляющее программное обеспечение.Этот нулевой вольтовый контроль будет определять любое фоновое окисление на интересуемом белке. Выберите Запустить данные AutoZero, а затем Обработать, а затем Готово. Наконец, поверните инжекторный клапан вниз в положение нагрузки.Поместите раствор для закалки в положение один на карусели коллектора продукта, затем измените флакон продукта на один в программном обеспечении управления системой. Непосредственно перед инъекцией смешайте 12,5 микролитра смеси аденина и белка с 12,5 микролитрами перекиси водорода. Пипеткой смесь вверх и вниз перемешайте, затем быстро раскрутите ее вниз.Ввести 25 микролитров этого раствора с помощью инъекционного порта в течение 10 секунд после смешивания. Переключите инжекторный клапан в положение впрыска и подождите, пока образец обрабатывается. Включите напряжение вспышки до 750 вольт на управляющей программе и повторите шаги маркировки.Затем запишите поглощение каждого образца. Сначала нажмите «Выбрать», затем вручную выберите начало и конец пикового поглощения. В доступном пространстве напишите в описание образца.Повторите это для всех полученных данных. Скопируйте и вставьте данные в электронную таблицу, чтобы рассчитать среднее изменение поглощения аденина для каждого напряжения. После того, как все образцы будут собраны, промывайте шприц-порт и контур образца, установив инжекторный клапан в положение нагрузки, и впрыскивайте 25 микролитров воды ВЭЖХ пять раз.Поверните инжекторный клапан в положение впрыска, чтобы промыть остальную часть системы водой ВЭЖХ. После промывки остановите поток, выйдите из программного обеспечения управления системой и выключите модули, начиная с коллектора продукта, модуля дозиметра, модуля фотолиза и, наконец, модуля флюидики. После окисления аденин, используемый для дозиметрии, уменьшает поглощение ультрафиолетовым излучением на 265 нанометров.Буфер 2 содержит радикальный поглотитель, который уменьшает изменение абсорбентности аденина по сравнению с буфером 1. Апомиоглобин модифицировали в присутствии перекиси водорода и аденина при четырех возрастающих напряжениях плазменной лампы. Было обнаружено шесть пептидов, с линейным увеличением окисления относительно изменения абсорбирующей аденина на 265 нанометров.Эти шесть окисленные пептиды помечены на кристаллической структуре миоглобина. Степень окисления, обнаруженного плазменной лампой высокого давления, намного выше, чем лазерным методом. Это увеличение связано с широким спектром ультрафиолетового излучения плазменной лампы высокого давления.Производя широкий спектр ультрафиолета, плазменная лампа высокого давления лучше перекрывает область поглощения перекиси водорода, что приводит к более эффективному производству гидроксильных радикалов путем фотолиза перекиси водорода по сравнению с эксимерным лазером Kr F и лазером Nd YAG. Плазменная лампа высокого давления значительно увеличивает производство гидроксильных радикалов сверх того, что обычно наблюдается с помощью эксимерного лазера Kr F. Использование 100 миллимолярной перекиси может вызвать высокий уровень фонового окисления.Если белковая система восприимчива к перекисному окислению, уменьшите концентрацию до 10 миллимоляров. Необратимая метка HRPF позволяет обрабатывать образцы, включая длительное сбраживание протеазы, вы можете добавить тандемную массовую метку для мультиплексирования и выполнить 2D-хроматографию, улучшая обнаружение пептидов и консоординат структурной информации.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Сочетание мокрой и сухой методы Lab в Руководстве по кристаллизации больших биспиральных, содержащих белки

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Изменение бакуловирусы векторы выражения производить выделяется растительных белков в клетках насекомых

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

В Vivo Hydroxyl радикальный белок следдля изучения взаимодействия белков в Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Производство рекомбинантных белков PRMT с использованием векторной системы экспрессии бакуловируса

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...