Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (R43GM125420 y R44GM125420).

1. Instalación del tubo capilar
<ol><li>Usando una piedra de hendidura de sílice, escinda capilar de sílice de 250 μm de diámetro interior (ID) a 27 pulgadas. Revise los extremos capilares para un corte limpio y recto.</li>
	<li>Cree dos ventanas de aproximadamente 15 mm de longitud quemando el recubrimiento de poliimida. A partir del "extremo inferior" hacer la primera ventana de fotólisis 90 mm de distancia del "extremo inferior" y la segunda ventana del dosímetro 225 mm de distancia del "extremo inferior".<br...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

Hay varios pasos críticos para asegurar el etiquetado adecuado de las proteínas durante cualquier experimento hrpf. En primer lugar, se selecciona un caudal adecuado y un tipo de inflamación de la fuente para asegurarse de que cada bolo de la muestra se irradia una vez. Esto asegura que la proteína se expone a un solo bolo de ▪oh recién formado. Una vez que una proteína se oxida, la estructura de la proteína de orden superior puede ser alterada. Para estar seguro de que la estructura de la proteína n...

La conformación de las proteínas y la estructura de orden superior (HOS) asociada son los principales determinantes de la función biológica adecuada y el comportamiento aberrante1. Lo mismo se aplica a los productos biofarmacéuticos, cuya estructura y actividad funcional depende de diversos aspectos de su producción y entorno. El cambio biofarmacéutico en el SCA se ha relacionado con reacciones adversas a fármacos (ADR) atribuidas a la farmacología indeseable y a la respuesta inmunológica del paciente2,3. La aparición de los ADR ha alertado a la industria biofarmacéutica sobre el papel crítico que juega la proteína HOS en la seguridad y eficacia de la bioterapéutica, y han establecido la necesidad de nuevos y mejorados análisis de HOS4.
La huella de proteína radical hidroxilo (HRPF) es una técnica prometedora para rastrear el cambio en la proteína HOS. Hrpf implica el etiquetado irreversible del exterior de una proteína con ▪OH seguido de espectrometría de masas (MS) análisis para identificar la superficie accesible solvente de la proteína5,6,7. Hrpf se ha utilizado con éxito para detectar defectos en la proteína HOS y su función8,9,caracterizar el HOS de anticuerpos monoclonales (mAb)10,11,12,13,determinar la unión Kd de un ligando14,y mucho más15,16,17,18,19. Un método común para generar el ▪OH para HRPF es la oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP), que emplea láseres UV rápidos y de alta energía para producir ▪OH a partir de la fotólisis deH2O2. En su mayor parte, FPOP utiliza costosos láseres excímeros que emplean gas peligroso (KrF) que exige protecciones sustanciales para evitar lesiones respiratorias y oculares20. Para evitar los peligros de inhalación, otros han utilizado láseres de granate de aluminio de neodimio cuadruplicadodefrecuencia (Nd: YAG), que elimina el uso de gases tóxicos pero siguen siendo costosos, requieren una experiencia operativa significativa y exigen amplios controles de luz extraviada para proteger a los usuarios de lesiones oculares.
Aunque se puede obtener amplia información utilizando HRPF, no se ha cumplido una amplia adopción en la biofarmacéutica. Dos barreras para la adopción limitada de HRPF incluyen: 1) el uso de láseres peligrosos y costosos que exigen precauciones de seguridad sustanciales20; y 2) la irreproducibilidad de la FCR causada por el barrido de fondo de ▪OH que limitan los estudios comparativos22. Para suplantar el uso del láser, se desarrolló una unidad de fotólisis de flash de plasma de alta velocidad y alta energía para realizar FPOP de forma segura de una manera fácil. Para mejorar la irreproducibilidad de los experimentos de HRPF, se implementa la dosimetría radical en tiempo real.
La práctica de HRPF ha sido limitada por la irreproducibilidad atribuida al barrido del fondo de ▪OH22. Mientras que ▪OH son sondas excelentes de la topografía de la proteína, también reaccionan con muchos componentes encontrados en preparaciones, haciéndole necesario medir la concentración eficaz de radical disponible para oxidar una proteína de la blanco. Las variaciones en la preparación del tampón, la concentración de peróxido de hidrógeno, las propiedades del ligando o la fotólisis pueden resultar en diferencias de oxidación entre los grupos de control y experimentales que crean ambigüedad en los estudios diferenciales de HOS. La adición de dosimetría radical en tiempo real permite el ajuste del efecto ▪carga de OH y, por lo tanto, aumenta la confianza y la reproducibilidad durante un experimento de HRPF. El uso de la dosimetría radical en FPOP se ha descrito en otra parte23,24,25,y se discute más detalladamente en una publicación reciente26. Aquí, se describe el uso de un nuevo sistema de fotólisis flash y dosimetría en tiempo real para etiquetar la apo-mioglobina equina (aMb), comparando los niveles de oxidación de péptidos en un experimento FPOP a la de obtenido cuando se utiliza un láser excímero.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

La huella de proteína radical hidroxilo (HRPF) es una técnica de análisis estructural de orden superior emergente y prometedora que proporciona información sobre los cambios en la estructura de la proteína, las interacciones proteína-proteína o las interacciones proteína-ligando. HRPF utiliza radicales hidroxilo(▪OH) para etiquetar irreversiblemente la superficie accesible del disolvente de una proteína. La complejidad inherente, el costo y la naturaleza peligrosa de la realización de HRPF han limitado sustancialmente la adopción de base amplia en la biofarmacia. Estos factores incluyen: 1) el uso de láseres complicados, peligrosos y costosos que exigen precauciones de seguridad sustanciales; y 2) la irreproducibilidad de HRPF causada por el barrido del fondo de ▪OH que limitan estudios comparativos. Esta publicación proporciona un protocolo para el funcionamiento de un sistema HRPF libre de láser. Este sistema HRPF libre de láser utiliza una tecnología de oxidación flash de fuente de luz de plasma de alta energía y alta presión con dosimetría radical en línea. La fuente de luz plasmática es más segura, más fácil de usar y más eficiente en la generación de radicales hidroxilo que los sistemas HRPF basados en láser, y el dosímetro radical en línea aumenta la reproducibilidad de los estudios. Combinado, el sistema HRPF sin láser aborda y supera las deficiencias y limitaciones mencionadas de las técnicas basadas en láser.

La fuente de plasma de alta presión junto con la dosimetría en tiempo real permite un mejor control de ▪rendimiento de OH para observar los cambios en la estructura de proteínas de orden superior con mayor precisión. La adición de adenina permite un dosímetro radical eficaz en tiempo real. Tras la oxidación, la adenina pierde absorbancia UV a 265 nm(Figura 2A). El cambio en la absorbancia de la adenina está directamente relacionado con la concentración de radicales disp...

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Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Este protocolo presenta un método para utilizar dosimetría radical en línea y una fuente de luz plasmática para realizar la huella de proteínas de oxidación flash. Este método reemplaza el peligroso láser UV para simplificar y mejorar la reproducibilidad de la oxidación fotoquímica rápida de los estudios de proteínas.

Huella De Proteína De Radicales Hidroxilo Libre De Láser Para Realizar Análisis Estructurales De Orden Superior De Proteínas

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

La huella de proteínas de radicales hidroxilo sin láser hace que la identificación de sitios de interacción de proteínas y regiones de cambio de confirmación sea mucho más fácil, acelerando la investigación en estudios de agregación, estructura y estabilidad de proteínas. Con la dosimetría radical en línea, los usuarios pueden ajustar la carga efectiva del radical hidroxilo en tiempo real, y con la dosimetría radical en tiempo real, puede ahorrar tiempo experimental y una muestra preciosa mientras mejora la reproducibilidad del etiquetado. Para comenzar, escinda un capilar de sílice de 250 micrómetros de diámetro interior a 27 pulgadas con una piedra de hendidura de sílice, revisando los extremos del capilar para un corte limpio y recto.Cree dos ventanas de aproximadamente 15 milímetros de longitud. Desde el extremo inferior del capilar, queme el recubrimiento de poliimida 90 milímetros hacia arriba para crear la ventana de fotólisis y 225 milímetros para la ventana dosimétrica. Inserte el extremo inferior del capilar justo más allá del extremo cónico de una tuerca y una férula.Añadir el capilar al puerto cinco, apretando justo más allá del dedo apretado con una llave inglesa. Retire la tapa de la celda de fotólisis del módulo de fotólisis tirando de ella directamente hacia fuera, luego retire la máscara de metal montada magnéticamente, que mantendrá el capilar en su lugar. Abra la celda del dosímetro presionando la pestaña de la izquierda y gire la celda del dosímetro abierta hacia la derecha.Retire los clips montados magnéticamente que mantendrán el capilar en su lugar. Luego coloque el capilar en el canal ranurado en la base de la celda de fotólisis y centre la ventana capilar con la ventana de la celda de fotólisis. Mantenga el capilar en su posición y agregue la máscara magnética.Vuelva a colocar la tapa de fotólisis en su posición. Coloque el capilar en el canal ranurado en la base de la celda del dosímetro y centre la segunda ventana capilar en la pequeña abertura en el centro de la celda del dosímetro. Mientras mantiene el capilar en posición con una mano, coloque los dos clips magnéticos en posición para mantener el capilar en su lugar.Cierre la celda del dosímetro hasta que haga clic en cerrar. Finalmente, inserte el capilar a través de la perilla a la parte superior de la elevación capilar del colector de producto, extendiendo el capilar justo por encima de la parte inferior del vial. Corte la longitud deseada de la tubería de teflón con un cortador y compruebe los extremos para un corte recto limpio.Inserte un extremo del nuevo bucle de inyección a través de una de las tuercas y coloque una nueva férula en el extremo del tubo. Mantenga la tuerca y la férula en su lugar mientras inserta el tubo en el puerto seis de la válvula de inyección hasta que salga de la parte inferior. Apriete la tuerca con una llave inglesa, luego confirme que la tuerca y la férula están firmemente en su lugar.Una vez que ambos extremos tienen una tuerca y una férula fija, atornille libremente un extremo al puerto tres y el otro extremo al puerto seis. Una vez en posición, apriete ambos lados para apretar el dedo, luego un cuarto de vuelta más allá del dedo apretado con una llave inglesa. Encienda el sistema HRPF sin láser iniciando el módulo de fluídica, seguido del módulo de fotólisis, el módulo dosímetro, el colector de productos y la computadora del sistema.Inicie el software del sistema. Sumerja completamente el tubo en 10 mililitros de tampón desde la posición de la válvula en la bomba de la jeringa. Dirija el tubo desde la posición de desecho y el tubo desde el puerto dos en el puerto de la jeringa a un contenedor vacío para recoger los desechos.Coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros en la posición marcada HN6 en el carrusel del colector de productos. Enjuague el bucle de inyección cinco veces inyectando 25 microlitros de agua de grado HPLC con la válvula configurada en la posición de carga. Gire manualmente la válvula de inyección para enjuagar el resto del sistema.Seleccione Proceso en el software de control para comenzar a fluir agua hasta que se forme una gota. Haga una solución que contenga dos adeninas milimolares y 10 proteínas micromolares. Luego haga una solución de temple usando 0.3 miligramos por mililitro catalasa y 35 milimolares de methianine amida.Alícuota 25 microlitros de solución de temple en un micro tubo de 200 microlitros. Diluya el peróxido de hidrógeno a 200 milimolares, manteniéndolo en hielo. Inicie el voltaje del flash a cero voltios en el software de control.Este control de cero voltios determinará cualquier oxidación de fondo en la proteína de interés. Seleccione Iniciar datos AutoZero, seguido de Proceso y, a continuación, Listo. Finalmente, gire la válvula de inyección hacia abajo a la posición de carga.Coloque la solución de temple en la posición uno en el carrusel del colector de producto y, a continuación, cambie el vial del producto a uno en el software de control del sistema. Inmediatamente antes de la inyección, mezcle 12,5 microlitros de la mezcla de adenina y proteínas con 12,5 microlitros de peróxido de hidrógeno. Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo para mezclar, a continuación, girar rápidamente hacia abajo.Inyecte 25 microlitros de esta solución utilizando el puerto de inyección dentro de los 10 segundos de la mezcla. Cambie la válvula de inyección a la posición de inyección y espere mientras se procesa la muestra. Suba el voltaje del flash a 750 voltios en el software de control y repita los pasos de etiquetado.A continuación, registre la absorbancia de cada muestra. En primer lugar, haga clic en Seleccionar y, a continuación, seleccione manualmente el principio y el final de la absorbancia máxima. En el espacio disponible, escriba una descripción del ejemplo.Repita esto para todos los datos adquiridos. Copie y pegue los datos en una hoja de cálculo para calcular el cambio promedio en la absorbancia de adenina para cada voltaje. Después de que se hayan recogido todas las muestras, enjuague el puerto de la jeringa y el bucle de la muestra colocando la válvula de inyección en la posición de carga e inyecte 25 microlitros de agua de HPLC cinco veces.Gire la válvula de inyección hasta la posición de inyección para enjuagar el resto del sistema con agua hplc. Una vez enjuagado, detenga el flujo, salga del software de control del sistema y apague los módulos, comenzando con el colector de producto, el módulo dosímetro, el módulo de fotólisis y, finalmente, el módulo de fluídica. Tras la oxidación, la adenina utilizada para la dosimetría disminuye en la absorbancia UV a 265 nanómetros.El almacenador intermediario 2 contiene un limpiador radical, que disminuye el cambio en la absorbancia de la adenina comparada al almacenador intermediario 1. Apomyoglobin fue modificado en presencia de peróxido de hidrógeno y de adenina en cuatro voltajes cada vez mayores de la lámpara del plasma. Se detectaron seis péptidos, con un aumento lineal de la oxidación con respecto al cambio de la absorbancia de la adenina a 265 nanómetros.Estos seis péptidos oxidados están etiquetados en una estructura cristalina de mioglobina. El grado de oxidación detectado en la lámpara de plasma de alta presión es mucho mayor que el método basado en láser. Este aumento surge del amplio espectro de emisión UV de amplio espectro de la lámpara de plasma de alta presión.Al producir un amplio espectro UV, la lámpara de plasma de alta presión se superpone mejor al dominio de absorbancia del peróxido de hidrógeno, lo que resulta en una producción más eficiente de radicales hidroxilo a través de la fotólisis del peróxido de hidrógeno, en comparación con el láser Kr F Excimer y el láser Nd YAG. La lámpara de plasma de alta presión aumenta significativamente la producción de radicales hidroxilo más allá de lo que normalmente se observa utilizando un láser Kr F Excimer. El uso de peróxido de 100 milimolares puede causar altos niveles de oxidación de fondo.Si el sistema proteico es susceptible a la oxidación inducida por peróxido, disminuya la concentración hasta 10 milimolaos. La etiqueta irreversible de HRPF permite el manejo de muestras aguas abajo, incluidas las digestiones largas de proteasas, puede agregar una etiqueta de masa en tándem para la multiplexación y realizar cromatografía 2D, todo lo cual mejora la detección de péptidos y concoordina la información estructural.

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