Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Detta arbete finansierades av National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 och R44GM125420).

1. Montering av kapillärröret
<ol><li>Använd en kiseldioxidklyvningssten och klyv 250 μm innerdiameter (ID) kiselkapillary till 27 tum. Kontrollera kapillärändarna för ett rent, rakt snitt.</li>
	<li>Skapa två fönster som är ungefär 15 mm långa genom att bränna bort polyimidbeläggningen. Från den "nedre änden" gör det första fotolysfönstret 90 mm från "nedre änden" och det andra dosimetmeterfönstret 225 mm från den "nedre änden". OBS: När beläggningen har bränts bort är kapillären mycket...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

Det finns flera kritiska steg för att säkerställa korrekt märkning av proteiner under alla HRPF-experiment. För det första väljs ett lämpligt flöde och källblixthastighet för att säkerställa att varje bolus i provet bestrålas en gång. Detta säkerställer att proteinet utsätts för en enda bolus av nybildad ▪OH. När ett protein oxideras kan proteinstrukturen i högre ordning ändras. För att vara säker på att den inhemska proteinstrukturen undersöks måste varje proteinmolekyl modifieras...

Proteinkonformation och tillhörande högre orderstruktur (HOS) är de viktigaste bestämningsfaktorerna för korrekt biologisk funktion och avvikande beteende1. Detsamma gäller biofarmaceutiska läkemedel, vars struktur och funktionella aktivitet är beroende av olika aspekter av deras produktion och miljö. Biofarmaceutiska förändringar i HOS har kopplats till biverkningar (ADR) som tillskrivs oönskad farmakologi och patientens immunologiskasvar 2,3. Utseendet på ADR har varnat den biofarmaceutiska industrin för den kritiska roll som protein HOS spelar för säkerheten och effektiviteten hos bioterapeuter, och de har fastställt behovet av ny och förbättrad HOS-analys4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) är en lovande teknik för att spåra förändringen i protein HOS. HRPF innebär irreversibel märkning av ett proteins exteriör med ▪OH följt av masspektrometri (MS) analys för att identifiera proteinets lösningsmedelsåliga yta5,6,7. HRPF har framgångsrikt använts för att upptäcka defekter i protein HOS och dessfunktion 8,9, karakterisera HOS av monoklonala antikroppar (mAb)10,11,12,13, bestämma bindningen Kd av en ligand14, och mycket mer15,16,17,18,19. En vanlig metod för att generera ▪OH för HRPF är Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP), som använder högenergiska, snabba UV-lasrar för att producera ▪OH från fotolys av H2O2. För det mesta använder FPOP dyra excimerlasrar som använder farlig gas (KrF) som kräver betydande skyddsåtgärder för att undvika andnings- och ögonskada20. För att undvika inandningsrisker har andra använt frekvensdubbelt neodym yttrium aluminium granat (Nd:YAG) lasrar21, vilket eliminerar användningen av giftig gas men fortfarande är kostsamma, kräver betydande operativ expertis och kräver omfattande herrelösa ljuskontroller för att skydda användare från ögonskada.
Även om riklig information kan erhållas med HRPF, har bred adoption i biopharma inte uppfyllts. Två hinder för det begränsade antagandet av hrpf omfattar: 1) användning av farliga och dyra lasrar som kräver betydande säkerhetsåtgärder20; och 2) Hrpf:s omöjlighet till följd av bakgrundsrensning av ▪OH som begränsar jämförande studier22. För att ersätta laseranvändning utvecklades en höghastighets, högenergi plasma flash fotolysenhet för att säkert utföra FPOP på ett enkelt sätt. För att förbättra okrmotståndligheten hos HRPF-experiment implementeras radikal dosimetri i realtid.
Hrpf-metoden har begränsats av irreproduktivitet som tillskrivs bakgrundsrensning av ▪OH22. Medan ▪OH är utmärkta sonder av proteintopografi, reagerar de också med många beståndsdelar som finns i preparat, vilket gör det nödvändigt att mäta den effektiva koncentrationen av radikaler som finns tillgängliga för att oxidera ett målprotein. Variationer i buffertberedning, väteperoxidkoncentration, ligandegenskaper eller fotolys kan resultera i oxidationsskillnader mellan kontroll- och experimentgrupper som skapar tvetydighet i HOS-differentierade studier. Tillägget av radikal dosimetri i realtid möjliggör justering av effekten ▪OH-belastning och ökar därför förtroendet och reproducerbarheten under ett HRPF-experiment. Användningen av radikal dosimetri i FPOP har beskrivits någon annanstans23,24,25, och diskuteras vidare i detalj i en ny publikation26. Här beskriver vi användningen av ett nytt flash fotolyssystem och dosimetri i realtid för att märka hästapo-myoglobin (aMb), jämföra nivåer av peptidoxidation i ett FPOP-experiment med det som erhålls vid användning av en excimerlaser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) är en framväxande och lovande strukturanalysteknik med högre ordning som ger information om förändringar i proteinstruktur, proteinproteininteraktioner eller protein-ligand interaktioner. HRPF använder hydroxylradikaler(▪OH) för att oåterkalleligen märka ett proteins lösningsmedelskomgängliga yta. Den inneboende komplexiteten, kostnaden och den farliga karaktären hos att utföra HRPF har avsevärt begränsat bredbaserad användning i biopharma. Dessa faktorer inkluderar: 1) användning av komplicerade, farliga och dyra lasrar som kräver betydande säkerhetsåtgärder; och 2) hrpf:s omöjlighet till följd av bakgrundsrensning av ▪OH som begränsar jämförande studier. Denna publikation ger ett protokoll för drift av ett laserfritt HRPF-system. Detta laserfria HRPF-system använder en högenergi, högtrycks plasma ljuskälla flash oxidation teknik med in-line radikal dosimetri. Plasmaljuskällan är säkrare, lättare att använda och effektivare när det gäller att generera hydroxylradikaler än laserbaserade HRPF-system, och den in-line radikala dosimetern ökar reproducerbarheten av studier. Tillsammans adresserar och övervinner det laserfria HRPF-systemet de nämnda bristerna och begränsningarna i laserbaserade tekniker.

Högtrycksplasmakällan i kombination med dosimetri i realtid möjliggör bättre kontroll av ▪OH-utbytet för att observera förändringar i högre proteinstruktur mer exakt. Tillsatsen av adenin möjliggör en effektiv radikal dosimeter i realtid. Vid oxidation förlorar adenin UV-absorbans vid 265 nm (figur 2A). Förändringen i adeninabsorbansen är direkt relaterad till koncentrationen av radikaler som är tillgängliga för HRPF och ger därmed ett sätt att effektivt öve...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Detta protokoll presenterar en metod för att använda inline radikal dosimetri och en plasma ljuskälla för att utföra flash oxidation protein fotavtryck. Denna metod ersätter den farliga UV-lasern för att förenkla och förbättra reproducerbarheten av snabb fotokemisk oxidation av proteinstudier.

Laserfri HydroxylRadikalt proteinavtryck för att utföra högre ordning strukturell analys av proteiner

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Laserfri hydroxylradikal proteinavtryck gör det mycket enklare att identifiera proteininteraktionsplatser och regioner med konfirmationsförändringar, vilket påskyndar forskningen inom proteinaggregering, struktur och stabilitetsstudier. Med inline radikal dosimetri kan användare justera den effektiva hydroxylradikala belastningen i realtid, och med radikal dosimetri i realtid kan du spara experimentell tid och värdefullt prov samtidigt som du förbättrar märkningens reproducerbarhet. Till att börja med klyva en 250 mikrometer inre diameter kiseldioxid kapillär till 27 tum med en kiseldioxid klyvande sten, kontrollera ändarna av kapillären för ett rent och rakt snitt.Skapa två fönster med ungefär 15 millimeters längd. Från kapillärens nedre ände, bränn bort polyimidbeläggningen 90 millimeter upp för att skapa fotolysfönstret och 225 millimeter för dosimeterfönstret. Sätt in kapillärens nedre ände strax bortom den koniska änden av en mutter och ferrule.Tillsätt kapillären i port fem och dra åt strax bortom fingret tätt med en skiftnyckel. Ta bort fotolyscelllocket på fotolysmodulen genom att dra den rakt ut och ta sedan bort den magnetiskt monterade metallmasken, som håller kapillären på plats. Öppna dosimetercellen genom att trycka på fliken till vänster och sväng dosimetercellen öppen åt höger.Ta bort de magnetiskt monterade klämmorna som håller kapillären på plats. Placera sedan kapillären i den räfflade kanalen vid basen av fotolyscellen och centrera kapillärfönstret med fotolyscellfönstret. Håll kapillären på plats och tillsätt magnetmasken.Placera fotolyslocket på plats igen. Placera kapillären i den räfflade kanalen vid basen av dosimetercellen och centrera det andra kapillärfönstret på den lilla bländaren i mitten av dosimetercellen. Placera de två magnetiska klämmorna på plats för att hålla kapillären på plats samtidigt som kapillären är på plats med en hand.Stäng dosimetercellen tills den klickar på stängd. Sätt slutligen in kapillären genom den räfflade ratten ovanpå produktuppsamlareens kapillärlyft och utöka kapillären till strax ovanför injektionsflaskan. Kapa önskad längd på Teflon-slangen med en fräs och kontrollera ändarna för ett rent rakt snitt.Sätt in ena änden av den nya injektionsslingan genom en av muttrarna och placera en ny ferrule på rörens ände. Håll muttern och hylsan på plats medan du sätter in röret i port sex på insprutningsventilen tills den bottnar ut. Dra åt muttern med en skiftnyckel och bekräfta sedan att muttern och järnet är ordentligt på plats.När båda ändarna har en mutter och fast ferrule, skruva löst ena änden till port tre och den andra änden till port sex. När du är på plats drar du åt båda sidor för att fingertäta, sedan en fjärdedel vrider förbi fingret tätt med en skiftnyckel. Slå på det laserfria HRPF-systemet genom att starta fluidikmodulen, följt av fotolysmodulen, dosimetermodulen, produktsamlaren och systemdatorn.Starta systemprogramvaran. Sänk ner slangen helt i 10 milliliter buffert från ventilläget på sprutpumpen. Rikta slangen från avfallsläget och slangen från port två på sprutporten till en tom behållare för att samla in avfall.Placera 1,5 milliliter mikrocentrifugrör i det läge som är märkt HN6 på produktfångarkarusellen. Skölj ut injektionsslingan fem gånger genom att injicera 25 mikroliter HPLC-vatten med ventilen inställd på lastpositionen. Vrid insprutningsventilen manuellt för att spola resten av systemet.Välj Process på kontrollprogramvaran för att börja flöda vatten tills en droppe bildas. Gör en lösning som innehåller två millimolar adenin och 10 mikromolekylärt protein. Gör sedan en släcklösning med 0,3 milligram per milliliter katalas och 35 millimolar methianine amide.Aliquot 25 mikroliter av släckande lösning i ett 200 mikroliter mikrorör. Späd väteperoxid till 200 millimolar och håll den på is. Starta blixtspänningen vid noll volt på styrprogramvaran.Denna nollvoltkontroll kommer att bestämma eventuell bakgrundsoxidation på proteinet av intresse. Välj Starta data automatisktZero, följt av Process sedan Klar. Slutligen vrider du ner insprutningsventilen till lastläget.Placera släpningslösningen på plats ett på produktfångarkarusellen och byt sedan produktflaskan till en på systemkontrollprogramvaran. Blanda omedelbart före injektionen 12,5 mikroliter av adenin- och proteinblandningen med 12,5 mikroliter väteperoxid. Pipetten blandningen upp och ner för att blanda, snurra sedan snabbt ner den.Injicera 25 mikroliter av denna lösning med injektionsporten inom 10 sekunder efter blandningen. Ställ in insprutningsventilen i injektionsläge och vänta medan provet bearbetas. Vrid upp blixtspänningen till 750 volt på styrprogramvaran och upprepa märkningsstegen.Registrera sedan absorbansen för varje prov. Klicka först på Välj och välj sedan manuellt början och slutet av toppabsorbansen. Skriv i en beskrivning av exemplet i det tillgängliga utrymmet.Upprepa detta för alla förvärvade data. Kopiera och klistra in data i ett kalkylblad för att beräkna den genomsnittliga förändringen i adeninabsorbans för varje spänning. När alla prover har samlats in, spola ut sprutporten och provslingan genom att ställa in insprutningsventilen i lastläge och injicera 25 mikroliter HPLC-vatten fem gånger.Vrid insprutningsventilen till injiceringsläget för att spola resten av systemet med HPLC-vatten. När du har spolat, stoppa flödet, avsluta systemkontrollprogramvaran och stäng av modulerna, börja med produktsamlaren, dosimetermodulen, fotolysmodulen och slutligen fluidikmodulen. Vid oxidation minskar adenin som används för dosimetri i UV-absorbans vid 265 nanometer.Buffert 2 innehåller en radikal asätare, vilket minskar förändringen i adeninabsorbans jämfört med buffert 1. Apomyoglobin ändrades i närvaro av väteperoxid och adenin vid fyra ökande plasma lampspänningar. Sex peptider upptäcktes, med en linjär ökning av oxidation med avseende på förändringen av adenin absorbans vid 265 nanometer.Dessa sex oxiderade peptider är märkta på en kristallstruktur av myoglobin. Omfattningen av oxidation som detekteras från högtrycksplasmalampan är mycket högre än den laserbaserade metoden. Denna ökning härrör från högtrycksplasmalampans breda spektrum UV-utsläppsspektrum.Genom att producera ett brett UV-spektrum överlappar högtrycksplasmalampan bättre absorbansdomänen för väteperoxid, vilket resulterar i en effektivare produktion av hydroxylradikaler genom fotolys av väteperoxid, jämfört med Kr F Excimer Laser och Nd YAG Laser. Högtrycksplasmalampan ökar produktionen av hydroxylradikaler avsevärt utöver vad som vanligtvis observeras med hjälp av en Kr F Excimer Laser. Användning av 100 millimolär peroxid kan orsaka höga nivåer av bakgrundsoxidation.Om proteinsystemet är mottagligt för peroxidinducerad oxidation, minska koncentrationen till så låg som 10 millimolar. HRPF: s irreversibla etikett möjliggör nedströms provhantering, inklusive långa proteas matsmältningar, du kan lägga till tandem mass tag för multiplexering och utföra 2D-kromatografi, allt förbättra peptiddetektering och koordinera strukturell information.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Kombinera våta och torra Lab Tekniker Guide kristallisation av stora coiled-coil proteiner

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modifiera baculoviridae uttryck vektorer att producera utsöndras växtproteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner av storlek-uteslutning kromatografi kopplad till multi-Angle ljus spridning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vi

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Inbyggt cellmembrannanopartiklar system för membranprotein-protein interaktionsanalys

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analys av SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution och Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produktion av rekombinanta PRMT-proteiner med baculovirusuttrycksvektorsystemet

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...