Name: laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (R43GM125420 ve R44GM125420) tarafından finanse edildi.

1. Kılcal borunun takılması
<ol><li>Bir silika dekolte taşı kullanarak, 250 μm iç çap (ID) silika kılcal damarı 27 inç'e bölün. Kılcal uçları temiz ve düz bir kesim için kontrol edin.</li>
	<li>Poliimid kaplamayı yakarak kabaca 15 mm uzunluğunda iki pencere oluşturun. "Alt uçtan" başlayarak, ilk fotoliz penceresini "alt uçtan" 90 mm ve ikinci dozimetre penceresini "alt uçtan" 225 mm uzağa yapın. NOT: Kaplama yandıktan sonra kılcal damar çok kırılgandır.</li>
	<li>5 numaralı bağlant...

<ol>
	<li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy.">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li><li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe:+a+regulatory+perspective.">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li><li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union.">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li><li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data:+starting+a+new+dialogue.">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li><li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding:+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting.">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li><li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament.">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin.">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li><li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+(FPOP)+for+Higher+Order+Structure+Characterization.">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li><li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting.">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li><li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting.">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li><li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks.">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li><li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+targeting+the+&#946;-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal.">Monoclonal antibody targeting the &#946;-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies.">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins:+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc.">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li><li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra.">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li><li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins(FPOP):+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool.">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li><li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting.">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li><li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data.">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li><li>Linde. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Linde Specialty Gases of North America. , (2009).</li><li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry.">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li><li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+(FPOP).">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li><li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar.">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).</li><li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor.">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).</li><li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry.">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li><li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes.">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li><li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale.">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis:+Fundamentals+and+Applications.">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).</li><li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping.">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody/Interleukin-23+Interaction+with+Hydrogen/Deuterium+Exchange,+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry,+and+Alanine+Shave+Mutagenesis.">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li><li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes,+Order+of+Binding,+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin.">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li><li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting.">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li><li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity.">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li><li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+paramyxovirus+fusion+(F)+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting.">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li><li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris(hydroxymethyl)aminomethane.">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li><li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry.">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li><li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity.">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li></ol>

Herhangi bir HRPF deneyi sırasında proteinlerin doğru etiketlenebilmesini sağlamak için birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, numunenin her bolusunun bir kez ışınlandığını emin olmak için uygun bir akış hızı ve kaynak flaş hızı seçilir. Bu, proteinin yeni oluşan ▪OH'nin tek bir bolus'una maruz kalmasını sağlar. Bir protein oksitlendikten sonra, daha yüksek sıralı protein yapısı değiştirilebilir. Yerli protein yapısının araştırıldığından emin olmak için, her prot...

Protein uyumu ve ilişkili yüksek düzen yapısı (HOS) uygun biyolojik fonksiyonun ve sapkın davranışın temel belirleyicileridir1. Aynı şey, yapısı ve fonksiyonel aktivitesi üretim ve çevrelerinin çeşitli yönlerine bağlı olan biyofarmasötikler için de geçerlidir. HOS'taki biyofarmasötik değişim, istenmeyen farmakoloji ve hasta immünolojik yanıtına atfedilen advers ilaç reaksiyonları (ADR) ile bağlantılıdır2,3. ADR'lerin ortaya çıkışı, biyofarmasötik endüstrisini protein HOS'un biyoterapötiklerin güvenliğinde ve verimliliğinde oynadığı kritik role karşı uyarmıştır ve yeni ve geliştirilmiş HOS analitiği ihtiyacını ortaya atmıştır4.
Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi (HRPF), protein HOS'taki değişimi izlemek için umut verici bir tekniktir. HRPF, proteinin5,6,7çözücü erişilebilir yüzeyini tanımlamak için kütle spektrometresi (MS) analizi ile takip edilen ▪OH ile bir proteinin dış yüzeyinin geri dönüşü olmayan etiketlemesini içerir. HRPF, protein HOS ve işlevi8 ,9,monoklonal antikorların HOS'u (mAb)10,11, 12,13,bir ligand14'ünbağlayıcı Kd'sini belirlemek ve çok daha fazlası15, 16,17,18,19'u karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. HRPF için ▪OH'yi oluşturmak için yaygın bir yöntem, H 2 O2fotolizisinden ▪OH üretmek için yüksek enerjili, hızlı UV lazerler kullanan Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonudur (FPOP). Çoğunlukla, FPOP solunum ve göz yaralanmalarını önlemek için önemli önlemler gerektiren tehlikeli gaz (KrF) kullanan pahalı excimer lazerler kullanır20. Soluma tehlikelerini önlemek için, diğerleri frekans dörtlü neodimyum alümünyum garnet (Nd:YAG) lazerlerikullandılar 21Toksik gaz kullanımını ortadan kaldırır, ancak hala maliyetlidir, önemli operasyonel uzmanlık gerektirir ve kullanıcıları göz yaralanmasından korumak için kapsamlı başıboş ışık kontrolleri talep eder.
HRPF kullanılarak geniş bilgi elde edilebilse de, biyofarmada geniş benimseme karşılanmadı. Sınırlı HRPF benimsemesi için iki engel şunlardır: 1) önemli güvenlik önlemleri gerektiren tehlikeli ve pahalı lazerlerin kullanımı20; ve 2) HRPF'nin, karşılaştırmalı çalışmaları sınırlayan ▪OH'nun arka plan çöplüğünden kaynaklanan irreproducibility22. Lazer kullanımını desteklemek için, FPOP'u facile bir şekilde güvenli bir şekilde gerçekleştirmek için yüksek hızlı, yüksek enerjili plazma flaş fotoliz ünitesi geliştirilmiştir. HRPF deneylerinin geri alınamazlığını geliştirmek için gerçek zamanlı radikal dozimetri uygulanır.
HRPF uygulaması, ▪OH22'ninarka plan çöplüğüne atfedilen geri alınamazlık ile sınırlanmıştır. ▪OH mükemmel protein topografyası probları olsa da, preparatlarda bulunan birçok bileşenle de reaksiyona girerek, hedef proteini oksitlemek için mevcut olan radikalin etkili konsantrasyonunun ölçülmesi gerekir. Tampon hazırlama, hidrojen peroksit konsantrasyonu, ligand özellikleri veya fotolizdeki varyasyonlar, HOS diferansiyel çalışmalarında belirsizlik yaratan kontrol ve deneysel gruplar arasında oksidasyon farklılıklarına neden olabilir. Gerçek zamanlı radikal dozimetrinin eklenmesi, OH yükü ▪etkinin ayarını sağlar ve bu nedenle bir HRPF deneyi sırasında güveni ve tekrarlanabilirliği arttırır. FPOP'ta radikal dozimetri kullanımı başka bir yerde açıklanmıştır23,24,25, ve yakın tarihli bir yayında daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır26. Burada, bir FPOP deneyindeki peptit oksidasyon seviyelerini bir ekscimer lazer kullanırken elde edilenlerle karşılaştırarak at apo-myoglobin 'i (aMb) etiketlemek için yeni bir flaş fotoliz sistemi ve gerçek zamanlı dozimetri kullanımını açıklıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>any brand is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L SGE Gastight Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SG-00723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &#181;m)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apomyoglobin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>any 30% hydrogen peroxide is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>03109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymicro Cleaving Stone, 1&#34; x 1&#34; x 1/32&#8221;</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068680064</td>
			<td>any capillary tubing cutter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LS118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins

Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi (HRPF), protein yapısındaki değişiklikler, protein-protein etkileşimleri veya protein-ligand etkileşimleri hakkında bilgi sağlayan gelişmekte olan ve umut verici bir yüksek sıralı yapısal analiz tekniğidir. HRPF, bir proteinin çözücü erişilebilir yüzeyini geri döndürülemez bir şekilde etiketlemek için hidroksil radikalleri(▪OH) kullanır. HRPF gerçekleştirmenin doğasında var olan karmaşıklık, maliyet ve tehlikeli doğa, biyofarmada geniş tabanlı benimsemeyi önemli ölçüde sınırladır. Bu faktörler şunlardır: 1) önemli güvenlik önlemleri gerektiren karmaşık, tehlikeli ve pahalı lazerlerin kullanımı; ve 2) HRPF'nin, karşılaştırmalı çalışmaları sınırlayan ▪OH'nun arka plan çöplüğünden kaynaklanan irreproducibility. Bu yayın, lazersiz bir HRPF sisteminin çalışması için bir protokol sağlar. Bu lazersiz HRPF sistemi, sıralı radikal dozimetriye sahip yüksek enerjili, yüksek basınçlı plazma ışık kaynağı flaş oksidasyon teknolojisini kullanır. Plazma ışık kaynağı lazer tabanlı HRPF sistemlerine göre hidroksil radikalleri üretmede daha güvenli, kullanımı daha kolay ve daha verimlidir ve hat içi radikal dozimetre çalışmaların tekrarlanabilirliğini artırır. Lazersiz HRPF sistemi, lazer tabanlı tekniklerin belirtilen eksikliklerini ve sınırlamalarını bir araya getirdiğini ve adını ortaya çıkarmaktadır.

Gerçek zamanlı dozimetri ile birleştirilen yüksek basınçlı plazma kaynağı, daha yüksek dereceli protein yapısındaki değişiklikleri daha doğru bir şekilde gözlemlemek için ▪OH veriminin daha iyi kontrol etmesini sağlar. Adenin eklenmesi etkili bir gerçek zamanlı radikal dozimetre sağlar. Oksidasyon üzerine, adenin UV emiciliğini 265 nm'de kaybeder(Şekil 2A). Adenin emiciliğindeki değişiklik, HRPF için mevcut olan radikallerin konsantrasyonu ile doğru...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins at JoVE.com

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Bu protokol, sıralı radikal dozimetri ve flaş oksidasyon proteini ayak izi gerçekleştirmek için bir plazma ışık kaynağı kullanmak için bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein çalışmalarının hızlı fotokimyasal oksidasyonunun tekrarlanabilirliğini basitleştirmek ve iyileştirmek için tehlikeli UV lazerin yerini alır.

Proteinlerin Daha Yüksek Sıralı Yapısal Analizini Gerçekleştirmek için Lazersiz Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Lazersiz hidroksil radikal protein ayak izi, protein etkileşim alanlarını ve onay değişim bölgelerini tanımlamayı çok daha kolay hale getirerek protein toplama, yapı ve stabilite çalışmalarındaki araştırmaları hızlandırır. Satır içi radikal dozimetri ile kullanıcılar etkili hidroksil radikal yükünü gerçek zamanlı olarak ayarlayabilir ve gerçek zamanlı radikal dozimetri ile etiketleme tekrarlanabilirliğini geliştirirken deneysel zamandan ve değerli numuneden tasarruf edebilirsiniz. Başlamak için, 250 mikrometre iç çaplı silika kılcal damarı bir silika sıkma taşı ile 27 inç'e bölün, kılcal damarın uçlarını temiz ve düz bir kesim için kontrol edin.Kabaca 15 milimetre uzunluğunda iki pencere oluşturun. Kılcal damarın alt ucundan, fotoliz penceresini oluşturmak için poliimid kaplamayı 90 milimetre ve dozimetre penceresi için 225 milimetreyi yakın. Kılcal damarın alt ucunu bir somun ve yüksük konik ucunun hemen ötesine yerleştirin.Kılcal damarı beş numaralı bağlantı noktasına ekleyin, parmağın hemen ötesinde bir anahtarla sıkın. Fotoliz modülünün fotoliz hücre kapağını doğrudan dışarı çekerek çıkarın, ardından kılcal damarı yerinde tutacak manyetik olarak monte edilmiş metal maskeyi çıkarın. Soldaki sekmeye basarak dozimetre hücresini açın ve dozimetre hücresini sağa doğru açın.Kılcal damarı yerinde tutacak manyetik olarak monte edilmiş klipsleri çıkarın. Daha sonra kılcal damarı fotoliz hücresinin tabanındaki yivli kanala yerleştirin ve kılcal pencereyi fotoliz hücre penceresiyle ortala. Kılcal damarı yerinde tutun ve manyetik maskeyi ekleyin.Fotoliz kapağını yerine yerleştirin. Kılcal damarı dozimetre hücresinin tabanındaki yivli kanala yerleştirin ve ikinci kılcal pencereyi dozimetre hücresinin ortasındaki küçük diyafram açıklığına ortala. Kılcal damarı bir elinizle yerinde tutarken, iki manyetik klipsi kılcal damarı yerinde tutacak şekilde yerleştirin.Dozimetre hücresini kapalı tıklatana kadar kapatın. Son olarak, kılcal damarı ürün toplayıcının kılcal kaldırmasının üzerine tırtıklı düğmeden geçirin ve kılcal damarı şişenin tabanının hemen üstüne uzatın. Bir kesici kullanarak teflon borunun istenen uzunluğunu kesin ve uçlarını temiz bir düz kesim için kontrol edin.Yeni enjeksiyon döngüsünün bir ucunun bir ucunun somunlardan birine yerleştirin ve tüpün ucuna yeni bir yüksük yerleştirin. Boruyu enjeksiyon vanasının altıncı portuna yerleştirirken somunu ve yükseği, dibe vurana kadar yerinde tutun. Somunu bir İngiliz anahtarı ile sıkın, ardından somun ve yüksüklerin güvenli bir şekilde yerinde olduğunu onaylayın.Her iki ucu da bir somun ve sabit yüksük olduğunda, bir ucunu üç numaralı bağlantı noktasına ve diğer ucunu altı numaralı bağlantı noktasına gevşek bir şekilde vidalayın. Pozisyon aldıktan sonra, her iki tarafı da sıkıca parmakla sıkın, ardından çeyrek bir anahtarla parmağı sıkıca geçin. Akışkanlar modülini başlatarak lazersiz HRPF sistemini açın, ardından fotoliz modülü, dozimetre modülü, ürün toplayıcı ve sistem bilgisayarı.Sistem yazılımını başlatın. Boruyu şırınna pompasının valf konumundan 10 mililitre tampona tamamen batırın. Boruyu atık konumundan ve boruyu şırınna limanındaki ikinci bağlantı noktasından boş bir kaba yönlendirerek atık toplayın.Ürün toplayıcı atlıkarınca üzerinde HN6 işaretli konuma 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüp yerleştirin. Valf yük konumuna ayarlanmış 25 mikrolitre HPLC sınıfı su enjekte ederek enjeksiyon döngüsünü beş kez durulayın. Sistemin geri kalanını yıkamak için enjeksiyon vanasını manuel olarak çevirin.Damlacık oluşana kadar akan suya başlamak için kontrol yazılımında İşlem'i seçin. İki milimoler adenin ve 10 mikromoler protein içeren bir çözelti yapın. Daha sonra mililitre katalaz başına 0,3 miligram ve 35 milimoler metianine amide kullanarak bir söndürme çözeltisi yapın.Aliquot 25 mikrolitre söndürme çözeltisi 200 mikrolitre mikro tüp içine. Hidrojen peroksit 200 milimolar seyreltin ve buzda tutun. Flaş voltajını kontrol yazılımında sıfır voltta başlatın.Bu sıfır volt kontrolü, ilgi proteini üzerindeki herhangi bir arka plan oksidasyonunu belirleyecektir. Verileri Otomatik Sıfırla'yı başlat'ı ve ardından İşlem'i ve ardından Hazır'ı seçin. Son olarak, enjeksiyon vanasını yük konumuna getirin.Söndürme solüsyonunu ürün toplayıcı atlıkarıncasına yerleştirin, ardından ürün şişesini sistem kontrol yazılımında bire değiştirin. Enjeksiyondan hemen önce, adenin ve protein karışımının 12,5 mikrolitresini 12,5 mikrolitre hidrojen peroksit ile karıştırın. Karışımı karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin, sonra hızla aşağı çevirin.Karıştırmadan sonraki 10 saniye içinde enjeksiyon portu kullanarak bu çözeltinin 25 mikrolitresini enjekte edin. Enjeksiyon vanasını enjeksiyon konumuna getirin ve numune işlenirken bekleyin. Flaş voltajını kontrol yazılımında 750 volta açın ve etiketleme adımlarını tekrarlayın.Ardından her numunenin emiciliğini kaydedin. İlk olarak, Seç'i tıklatın, sonra tepe emiciliğinin başlangıcını ve sonunu el ile seçin. Kullanılabilir alana, örneğin bir açıklamasını yazın.Elde edilen tüm veriler için bunu yineleyin. Her voltaj için adenin emiciliğindeki ortalama değişimi hesaplamak için verileri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın. Tüm numuneler toplandıktan sonra, enjeksiyon vanasını yük konumuna indirerek şırınga portunu ve numune döngüsünü boşaltın ve beş kez 25 mikrolitre HPLC suyu enjekte edin.Sistemin geri kalanını HPLC suyuyla yıkamak için enjeksiyon vanasını enjeksiyon konumuna getirin. Temizlendikten sonra akışı durdurun, sistem kontrol yazılımından çıkın ve ürün toplayıcı, dozimetre modülü, fotoliz modülü ve son olarak akışkanlar modülü ile başlayarak modülleri kapatın. Oksidasyon üzerine, dozimetri için kullanılan adenin 265 nanometrede UV emiliminde azalır.Buffer 2, Tampon 1'e kıyasla adenin absorbansındaki değişimi azaltan radikal bir çöpçü içerir. Apomyoglobin, hidrojen peroksit ve adenin varlığında dört artan plazma lamba geriliminde modifiye edildi. 265 nanometrede adenin emiliminin değişimine bağlı olarak oksidasyonda doğrusal bir artışla altı peptit tespit edildi.Bu altı oksitlenmiş peptit miyoglobin kristal yapısı üzerinde etiketlenmiştir. Yüksek basınçlı plazma lambadan tespit edilen oksidasyonun boyutu lazer tabanlı yöntemden çok daha yüksektir. Bu artış, yüksek basınçlı plazma lambasının geniş spektrumlu UV emisyon spektrumundan kaynaklanmaktadır.Geniş bir UV spektrumu üreterek, yüksek basınçlı plazma lambası hidrojen peroksitin absorbans alanıyla daha iyi örtüşür ve kr F Excimer Laser ve Nd YAG Laser ile karşılaştırıldığında hidrojen peroksitin fotolizi yoluyla hidroksil radikallerinin daha verimli bir şekilde üretilmesine neden olur. Yüksek basınçlı plazma lamba, hidroksil radikallerinin üretimini kr F Excimer Lazer kullanılarak tipik olarak gözlemlenenin ötesinde önemli ölçüde artırır. 100 milimoler peroksit kullanmak yüksek düzeyde arka plan oksidasyonuna neden olabilir.Protein sistemi peroksit kaynaklı oksidasyona duyarlıysa, konsantrasyonu 10 milimolar kadar düşürür. HRPF'nin geri dönüşü olmayan etiketi, uzun proteaz sindirimi de dahil olmak üzere aşağı akış numune işlemeye izin verir, çoklama için birlikte kütle etiketi ekleyebilir ve 2D kromatografi yapabilirsiniz, hepsi peptit algılamasını iyileştirir ve yapısal bilgileri birleştirir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Boyutlar-dışlama kromatografi ile çok açılı ışık saçılmasına bağlı proteinlerin karakterizasyonu (SEC-,)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

EFA deconvolution ve Scatter ile SEC-SAXS verilerinin analizi

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...