Name: study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy at JoVE.com

Denne forskning brugte ressourcer på Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biologi og Kemi laboratorier), et DOE Office of the Science User Facility, der drives af Oak Ridge National Laboratory. Denne forskning brugte også ressourcer på MLZ-FRM2-reaktoren Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) og JCNS1 på Forschungszentrum Jülich GmbH, Tyskland. Forfatteren anerkender Dr. Ralf Biehl og Dr. Andreas Stadler for deres hjælp med modellering og deres bidrag til både IgG- og MBP-proteinforskning, Dr. Piotr A. Żołnierczuk for NSE-datareduktionsstøtte, Dr. Changwoo Do for støtte med SANS-målinger og Rhonda Moody og Dr. Kevin Weiss for SNS biokemilaboratoriestøtte.

Det nuværende arbejde karakteriserer to proteiner: et almindeligt humant antistofprotein IgG og det iboende forstyrrede MBP. Den frysetørrede form af proteinerne blev opnået fra kommercielle kilder (se Materialetabel).
1. Forberedelse af proteinprøver
<ol><li>Der fremstilles en 50 mM natriumphosphat + 0,1 M NaCl buffer ved vejning og opløsning af de respektive faste reagenser i tungt vand (D2O) (se materialetabel). Dette er d...

NSE-spektroskopi giver et unikt og detaljeret billede af proteinernes dynamik, som andre spektroskopiske teknikker ikke kan producere. Målinger over en længere tidsskala giver observationer af både proteinernes translationelle og rotationsdiffusion, som præsenteret her. Segmentdynamikken og andre interne svingninger afslører sig som et stærkt henfald af den sammenhængende spredningsfunktion S(Q, t) på en kort tidsskala og er godt adskilt fra de overordnede diffusionsafspændingsprocesser. De vigtigste be...

Sonderende dynamik af blødt stof med neutroner Undersøgelse af proteiners og peptiders dynamiske egenskaber er en stor del af biofysisk forskning, og der findes i dag mange veludviklede metoder til at få adgang til en bred vifte af energilandskaber1. At relatere proteinernes eksperimentelt afslørede dynamik til deres biologiske funktion er en langt vanskeligere opgave, der kræver komplekse matematiske modeller og computerstøttede dynamiksimuleringer. Betydningen af neutronspektroskopi for analyse af proteinbevægelser er blevet understreget i flere velmodtagne og bredt anerkendte undersøgelser 1,2,3,4,5. Før du udforsker det mangfoldige energilandskab af intern proteindynamik, kræves der et kort overblik over de dynamiske processer i blødt stof, og hvordan neutroner kan få adgang til dem.
Neutronernes følsomhed over for isotopkonfiguration og den type interaktioner, de viser med blødt stof, gør neutronspredning til en af de mest alsidige undersøgelsesteknikker6. Der er et bredt spektrum af korrelationslængdeskalaer og korrelationstider, som neutroner kan få adgang til, fra nukleare excitationer og atomvibrationer til kollektive bevægelser og langsomme afslapningsprocesser som isotropiske rotationer og diffusive bevægelser. Når man undersøger de spredte neutroner for deres energioverførsel, kan der skelnes mellem tre hovedinteraktioner: den elastiske spredning, hvor der ikke er nogen energiudveksling mellem indkommende neutron og partikel i prøven; den uelastiske spredning med en stor, kvantificerbar energiudveksling mellem neutron og partikel; og det ejendommelige tilfælde af kvasi-elastisk spredning, der betegner en meget lille energioverførsel sammenlignet med den indfaldende neutronenergi 1,7. Disse interaktioner giver præcise oplysninger om det undersøgte materiale og danner det teoretiske grundlag for en lang række neutronspredningsteknikker.
I elastisk spredning registrerer detektoren neutronernes retninger som et diffraktionsmønster, der viser prøveatomernes position i forhold til hinanden. Oplysninger om korrelationerne mellem atompositioner erhverves (dvs. integreret intensitet S (Q) vedrørende momentumoverførslen Q, som kun vedrører strukturel information). Dette princip danner grundlaget for neutrondiffraktion8.
Kompleksitet opstår, når energioverførslen ikke længere er nul på grund af excitationer og interne udsving i prøvematerialet. Dette danner grundlag for neutronspektroskopi, hvor de spredte neutroner undersøges som en funktion af både energioverførslen E og momentumoverførslen Q. Dynamisk og strukturel information opnås. Neutronspektroskopi måler den samme integrerede intensitet S(Q) for energioverførsel (dvs. hastighedsændring af neutronerne på grund af prøvespredning, S(Q,ω) = S(Q, E), som også kaldes den dynamiske strukturfaktor)9.
Til beregning af spredningen fra et materiale er det mere hensigtsmæssigt at anvende parkorrelationsfunktionen 7,10. I diffraktionssagen giver den statiske parkorrelationsfunktion G (r) sandsynligheden for at finde midten af en partikel i en given afstand r fra centrum af en anden partikel. Spektroskopien generaliserer den statiske parkorrelationsfunktion og inkluderer energi / frekvens / tid i spredningsligningen. Parkorrelationsfunktionen G(r) bliver en funktion af tiden G(r, t), som kan nedbrydes til en særskilt atomparkorrelationsfunktion GD(r, t) og en selvkorrelationsfunktion GS(r, t). Disse beskriver to typer korrelationer: parkorrelerede bevægelser af atomer, der styrer den sammenhængende spredning, og selvkorrelation, der styrer den usammenhængende spredning10.
Sammenhængende spredning er spredningen fra "gennemsnittet" og afhænger af den relative fase af de spredte bølger. I småvinkelspredningsregimet interfererer de spredte neutronbølger fra forskellige spredningscentre (forskellige atomer) konstruktivt (har lignende faser), og atomernes kollektive bevægelse observeres med stærk intensitetsforbedring. Sammenhængende spredning beskriver i det væsentlige spredningen af en enkelt neutron fra alle kernerne i prøve10.
Når der ikke opstår nogen konstruktiv interferens mellem de spredte neutronbølger fra forskellige centre, følges et enkelt atom i tide, og selvkorrelationen mellem atomets position på tidspunktet t = 0 og det samme atom på tidspunktet t observeres. Således går oplysningerne om atomernes relative positioner tabt, og fokus er kun på lokale udsving. Spredning fra lokale udsving styrer usammenhængende spredning. Usammenhængende spredning er isotrop, bidrager til baggrundssignalet og nedbryder signal-til-støj10,11.
Ved at kombinere alt det ovenstående skelner vi mellem fire store neutronspredningsprocesser10: (1) elastisk sammenhængende (måler korrelationerne mellem atompositioner), (2) uelastisk sammenhængende (måler kollektive bevægelser af atomer), (3) elastisk usammenhængende (bidrager til baggrunden, reducerer spredningsintensiteten ved Debye-Waller-faktor (DWF) og måler elastisk usammenhængende strukturfaktor (EISF), der beskriver geometrien af diffusive bevægelser i begrænset geometri, og (4) uelastisk usammenhængende (måler enkeltatomdynamik og selvkorrelation).
Dynamikprocesser, som neutroner kan få adgang til i biologi, spænder fra dæmpning af lavfrekvente atomare og molekylære vibrationer, interaktionen mellem opløsningsmiddelmolekyler og biooverflader og diffusionsprocesser i hydreringslaget af makromolekyler og begrænset geometri til kortdistance translationelle, roterende og tumlende diffusive bevægelser og proteindomæner og allosteriske bevægelser1 . Den brede mangfoldighed af neutronmetoder og instrumenter til måling af proteindynamik er baseret på, hvordan akromatiseringen af den indfaldende eller udgående neutronstråle opnås, og hvordan energianalysen af de spredte neutroner udføres. Fra triple-axis til time-of-flight, backscattering og spin-echo spektrometre kan man udforske dynamiske processer med karakteristiske tider mellem 1 x 10-14 s og 1 x 10-6 s (femtosekund til mikrosekunder)12.
Oak Ridge National Laboratory, med sine to berømte neutronkilder, Spallation Neutron Source - SNS13 og High Isotope Flux Reactor - HFIR14, har en af de bedste suiter af spektrometre til undersøgelse af dynamik i biomaterialer. Nogle af de mest veltalende eksempler inkluderer brugen af det kolde neutronhakkerspektrometer (CNCS) ved SNS15 til at undersøge den dynamiske forstyrrelse af hydreringsvand omkring grønt fluorescerende protein i opløsning16 eller de sub-picosekund kollektive vibrationer af flere proteiner17. Et tilbagevendende problem med uelastiske neutronspredningsundersøgelser er, at nogle biologiske processer er for langsomme til at blive observeret. Uden ekstreme opsætninger, der fører til et enormt tab af neutronintensitet, er time-of-flight-spektrometre begrænset til 10 μeV energiopløsning, svarende til en maksimal tidsskala på ~ 200 ps10,11. Dette er ikke tilstrækkeligt til at observere store bevægelser i proteiner. Derfor er der ofte brug for instrumenter med højere energiopløsning som backscattering-spektrometrene. Kombinationen af flyvetids- og backscatteringsteknikker har vist sig at være effektiv til at undersøge ændringen i den interne dynamik i Cytochrome P450cam (CYP101), et enzym, der katalyserer hydroxyleringskamferen18.
Mikroskopisk diffusivitet målt ved backscattering-spektrometeret ved SNS-BASIS19 var overraskende veldefineret og kunne adskilles i diffusiviteten af vand (hydrering, cytoplasmisk og bulklignende vand) og diffusiviteten af cellebestanddele i planariske fladorme, det første levende dyr, der blev undersøgt ved neutronspredning20 . Backscattering er en højopløsningsspektroskopisk teknik, men den er også begrænset til flere μeV = flere nanosekunder, mens den langsomme dynamik i biomaterialer også manifesterer sig som overlevelsestiden for korrelation mellem atomposition eller spinorientering (f.eks. Afslapningsprocesser, som regelmæssigt sker i tidsintervallet ti til hundreder af nanosekunder).
Neutron spin ekko spektroskopi (NSE) er den eneste neutronspredningsteknik, der når så høj opløsning. I modsætning til andre neutronteknikker kræver NSE ikke akromatisering af strålen, da den bruger neutronernes kvantemekaniske fase, som er deres magnetiske øjeblikke. Manipulationen af magnetiske øjeblikke tillader anvendelse af en bred neutronstrålebølgelængdefordeling, mens teknikken er følsom over for meget små neutronhastighedsændringer i størrelsesordenen 1 x 10-4. NSE er med succes blevet brugt til at undersøge den langsomme dynamik af proteiner i opløsning for mange proteiner. Blandt disse mange pionerstudier anerkender vi undersøgelsen af segmentfleksibiliteten af svineimmunoglobulin21; de koblede domænebevægelser i Taq-polymerase22; domænebevægelserne i tetrameren af gæralkoholdehydrogenase23; ændringen af konformation i phosphoglyceratkinase ved substratbinding3; aktivering af domænebevægelser og dynamisk udbredelse af allosteriske signaler i Na+/H+-udvekslingsregulerende cofaktor 1 (NHERF1)-proteinet 4,24,25 dynamikken i en kompakt tilstand af mercurisk ionreduktase26; og diffusion af hæmoglobin i røde blodlegemer27. To nyere undersøgelser i proteindynamik har afsløret fleksibiliteten af humant antistof Immunoglobulin G (IgG) som en entropisk forår28 og egenskaberne ved opløsningsmiddelbidrag til dynamikken i iboende forstyrret myelinbasisk protein (MBP)5.
Denne artikel forklarer de grundlæggende principper for NSE, de mange forberedende metoder, der anbefales til en grundig proteindynamikundersøgelse, samt metoden og den eksperimentelle protokol til NSE-dataindsamling ved NSE-spektrometeret ved SNS, SNS-NSE. Protokollen karakteriserer to proteiner: IgG, et almindeligt humant antistofprotein, og det iboende uordnede protein MBP. De biofysiske implikationer, eksemplernes forskningsrelevans og teknikkens begrænsninger diskuteres kort.
NSE-spektroskopi, metoden til målinger af langsom dynamik NSE er en polariseret teknik, der bruger neutron-time-of-flight til at måle udvekslingen af energi (tab af polarisering) på grund af den kvasi-elastiske interaktion mellem neutroner og atomer i en prøve. Kernen i NSE-spektroskopi ligger to grundlæggende principper: (1) neutronspinets evne til at præcessere i magnetfeltet med en frekvens, der er proportional med magnetisk styrke <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61862/61862eq01.jpg" style="margin: auto;">, nemlig Larmor-frekvensen29, og (b) spin-ekkoet eller Hann-ekkoet, der repræsenterer manipulation og refokusering af polarisationssignalet, når der anvendes en række radiofrekvensimpulser30.
Det grundlæggende i NSE-processen kan opsummeres i et par enkle trin 6,11 ved hjælp af figur 1. (1) Neutronstrålen produceret af kilden (position 1) polariseres (position 2), styres og transporteres (position 3) og ankommer til indgangen til NSE-spektrometeret, hvor den roteres med 90 ° af den første pi-half flipper (position 4). (2) Den polariserede stråle (f.eks. neutronmagnetiske øjeblikke) bliver vinkelret på den første magnets magnetfeltlinjer (første præcessionszone, position 5) og begynder at gå forud. (3) I slutningen af magneten akkumulerer neutronspins en bestemt præcessionsvinkel, der er proportional med magnetfeltstyrken og flyvetiden brugt indeni (stort set omvendt proportional med neutronhastigheden). De enkelte neutronhastigheder er kodet inden for deres præcessionsvinkel i slutningen af den første præcessionszone. (4) Tæt på prøvepositionen vender pi-flipperen (position 6) orienteringen af spin med 180° og ændrer tegnet på præcessionsvinklen. (5) Neutronerne interagerer med prøvens molekyler (position 7) og bliver spredt. (6) De spredte neutroner kommer ind og går ind i den anden præcessionszone (position 8), men bliver omvendt orienterede. (7) En anden pi-half flipper (position 9) bruges til at rotere spinnets retning fra vinkelret på vandret retning. Dette vil stoppe præcessionen og oversætte præcessionsvinklen φ til polarisering proportional med cos (φ). (8) Analysatoren (position 10) vælger neutronerne baseret på en retning. Hvis interaktionen med prøven er elastisk, ændres neutronens hastighed ikke. Neutronerne vil bruge en identisk mængde tid på at flyve i den første og anden præcessionszone, og de akkumulerede præcessionsvinkler genvindes fuldt ud. Den fulde polarisering genoprettes på detektoren (position 11) som et ekko af den oprindelige polarisering (dvs. spin-ekko). (9) I NSE er spredningen imidlertid kvasi-elastisk, så en lille energiudveksling mellem neutroner og prøvemolekyler fører til forskellige neutronhastigheder efter spredning af prøven. På grund af de forskellige hastigheder vil neutronerne bruge en ekstra tid på at flyve gennem den anden præcessionszone og vil ikke have genoprettet deres præcessionsvinkel korrekt. En delvis polarisering hentes på detektoren, og tabet af polarisation på grund af spinafslapning er proportional med cos-Fourier-transformationen af spektralfunktionen S(Q, ω), den mellemliggende spredningsfunktion F(Q, t). (10) Tidsparameteren for funktionen F(Q, t) er proportional med præcessionens magnetfeltstyrke. Scanning af tabet af polarisation som en funktion af magnetfeltstyrken giver derfor en afslapningsfunktion, der afhænger af de dynamiske processer i prøven.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig01.jpg"> Figur 1: Fotografi af NSE-spektrometeret ved SNS (SNS-NSE) og neutronfluebane skematisk med de vigtigste funktionelle komponenter. Fra højre mod venstre: 1 = neutronkilde; 2 = choppers-bender-polarizer-sekundær lukkersystem; 3 = bjælketransport guider; 4 = pi/2 flipper til første 90° spin-turn; 5 = første præcessionszone; 6 = pi flipper til 180 ° spin-turn; 7 = prøveareal og prøvemiljø (her vises kryoovnen); 8 = anden præcessionszone; 9 = pi/2 flipper til anden 90° spin-turn; 10 = analysator; 11 = detektor. (Bemærk, at dele af 3, såvel som 2 og 1, er placeret bag den blå væg inde i afskærmning; chopperne erstattes af en hastighedsvælger til reaktorbaseret NSE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine MBP protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1891</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O - heavy water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 151882</td>
			<td>liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionized water</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>for washing / cleanning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS instrument</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>dynamic light scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic scattering standards</td>
			<td>SNS-NSE, ORNL</td>
			<td>-</td>
			<td>Al2O3&#160; and Graphite powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>65350-M</td>
			<td>70% ethanol for cleaning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWS-2 instrument</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle neutron instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquinox dish detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>-</td>
			<td>Phosphate-free liquid lab glassware cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9390</td>
			<td>disodium phosphate heptahydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9888</td>
			<td>sodium chloride salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. S9638</td>
			<td>monosodium phosphate monohydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Catalog number:&#160;ND-2000</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutron alignment camera</td>
			<td>NeutronOptics, Grenoble</td>
			<td>NOG210222</td>
			<td>100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - wax parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td>
			<td>all-purpose laboratory film in cardboard dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-J-NSE Spectrometer</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SasView</td>
			<td>https://www.sasview.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXSpace, Anton Paar instrument</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle x-ray instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88400-88405</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS Remote Analysis Cluster</td>
			<td>Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)</td>
			<td>https://analysis.sns.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS-NSE spectrometer</td>
			<td>ORNL, Oak Ridge, TN, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N.A. PN:28145-501</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Forcing System (TFS)</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Part Number 100004055</td>
			<td>sample environment equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea -d4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 176087</td>
			<td>deuterated Urea salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscometer</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>falling ball viscometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy

De fleste menneskelige kropsproteiners aktivitet og funktionalitet er relateret til konfigurationsændringer af hele underdomæner inden for proteinkrystalstrukturen. Krystalstrukturerne bygger grundlaget for enhver beregning, der beskriver strukturen eller dynamikken i et protein, det meste af tiden med stærke geometriske begrænsninger. Disse begrænsninger fra krystalstrukturen er imidlertid ikke til stede i opløsningen. Strukturen af proteinerne i opløsningen kan afvige fra krystallen på grund af omlejringer af sløjfer eller underdomæner på pico til nanosekund tidsskala (dvs. det interne proteindynamiktidsregime). Det nuværende arbejde beskriver, hvordan langsomme bevægelser på tidsskalaer på flere titalls nanosekunder kan tilgås ved hjælp af neutronspredning. Især den dynamiske karakterisering af to store humane proteiner, et iboende uordnet protein, der mangler en veldefineret sekundær struktur og et klassisk antistofprotein, behandles ved neutron spin ekkospektroskopi (NSE) kombineret med en bred vifte af laboratoriekarakteriseringsmetoder. Yderligere indsigt i proteindomænedynamik blev opnået ved hjælp af matematisk modellering til at beskrive de eksperimentelle neutrondata og bestemme crossover mellem kombinerede diffusive og interne proteinbevægelser. Ekstraktionen af det interne dynamiske bidrag til den mellemliggende spredningsfunktion opnået fra NSE, herunder tidsskalaen for de forskellige bevægelser, tillader yderligere syn på de mekaniske egenskaber af enkeltproteiner og proteinernes blødhed i deres næsten naturlige miljø i den overfyldte proteinopløsning.

IgG-protein fra humant serum og bovint MBP-protein blev rekonstitueret i høje koncentrationer (~ 50 mg / ml) i D2O-basebuffere. Da proteinerne blev opløst i høje koncentrationer, var de opnåede opløsninger overfyldte proteinopløsninger. Dynamikken undersøgt ved hjælp af NSE lider af det overfyldte miljø, som proteinerne befinder sig i (strukturfaktorinteraktioner og hydrodynamikeffekter)5,28,39. DLS blev udf?...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy at JoVE.com

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Denne protokol beskriver metoder til undersøgelse af strukturen og dynamikken i to modelproteiner, der har en vigtig rolle i menneskers sundhed. Teknikken kombinerer bench-top biofysisk karakterisering med neutron spin ekko spektroskopi for at få adgang til dynamikken på tids- og længdeskalaer, der er relevante for protein interdomain bevægelser.

Undersøgelse af proteindynamik via neutronspinekkospektroskopi

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

Følgende protokol præsenterer, hvordan man opretter et Neutron Spin Echo-eksperiment til måling af den mellemliggende spredningsfunktion og undersøger dynamikken i proteiner i opløsning. Den største fordel ved Neutron Spin Echo Spectroscopy er dens evne til at se på omlejring af proteindomæner og underdomæner på pico til nanosekund tidsskala; som er rækkevidden af langsomme bevægelser i proteiner i deres næsten naturlige miljø og i den overfyldte proteinopløsning. Neutron Spin Echo er også følsom over for isotopkonfiguration, hvilket muliggør meget specifikke og målrettede undersøgelser ved hjælp af kontrastmatchning.Indsigt i proteindomænedynamik er en stor del af den biofysiske forskning i den igangværende vanskelige opgave at videreformidle proteinernes bevægelser med deres biologiske funktionalitet. Protokollen, der præsenteres her, kan generelt anvendes på enhver Neutron Spin Echo-måling udført på SNS-NSE-spektrometeret, uanset dit valg af prøver, hvis man holder sig inden for rammerne af bløde stofmaterialer. For at oprette eksperimentet skal du begynde med at vælge tykkelsen af celleprøvebelastningen baseret på koncentrationen af proteinprøven, den temperatur, der er nødvendig til måling, og mængden af tilgængelig opløsning.Rengør cellen med fosfatfrit opvaskemiddel, deioniseret vand og 70% diethanol. Tør cellen i konvektionsovnen. Hæld fire milliliter proteinopløsning i cellen, og luk med hætter.Brug voksfilm eller ethvert fugemasse til at forsegle prøvecellerne. Læg fire milliliter dialysebuffer i en identisk beholder som proteinprøven og forseglingen. Transportprøver til strålelinjen.Luk lukkeren, og gå ind i spektrometerindkapslingens huleområde. Prøvecellen monteres på aluminiumsprøveholderen ved at stramme skruerne og holdepladerne. Grafitprøven og aluminiumoxidpulverprøven anbringes i en identisk beholder som proteinprøven.Placer den samme holder ved forsigtigt at skubbe den ind i dåsen på temperaturtvingningssystemet. Luk temperaturtvangssystemets låg, og indstil temperaturen til den ønskede værdi ved at få adgang til den interaktive skærm på temperaturtvingningssystemet. Monter neutronkameraet til justering af prøverne til strålen.For at indsamle neutronspinekkospektroskopidataene skal du justere prøven i neutronstrålen ved hjælp af neutronkameraet og de fire uafhængige prøveåbninger. Åbn Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy dataindsamlingssoftware, og indsaml prøvestatistikker ved at køre defraktionsscanninger for de ønskede spredningsvinkler og bølgelængde. Konfigurer måleparametrene baseret på de statistikker, der er indsamlet for hvert eksempel, ved at redigere de målemakroer, der leveres af hjælpeinstrumentforskeren.Start scanningen ved at skrive protokolnavnet ved kommandoprompten og hente ekkoer til prøven. Log ind på Neutron Sciences Remote Analysis-klyngen med ORNL-brugeroplysningerne, og tryk på knappen startsession. Åbn et terminalvindue i brugermappen, og skriv kommandoen til softwareopsætning.Skriv derefter miljøkommandoen. Opret en mappe til datareduktion i hjemmemappen, og kopier de medfølgende scripts og makroer fra den delte mappe. Rediger, omdøb og gem den reduktionsmakro, der leveres i overensstemmelse hermed.Skriv drspine "ved kommandoprompten, og tryk på Enter for at starte softwarereduktionsmiljøet. Skriv navnet på reduktionsmakroen i kommandoprompten i softwaremiljøet, og tryk på Enter.Rediger funktionen, så den passer fra det angivne bibliotek. Skriv navnet på det redigerede script ved kommandoprompten, og tryk på Enter for at læse, tilpasse og plotte reducerede NSE-data. Den mellemliggende spredningsfunktion målt ved NSE for IgG- og MBP-proteiner viser en klar afvigelse fra en simpel diffusionslignende afslapningsproces på den korte fireårige tidsskala, hvilket indikerer tilgængeligheden af proteinintern dynamik ved NSE og behovet for en mere kompleks model til at beskrive de observerede dynamiske processer.Resultaterne af mellemliggende spredningsfunktionsberegninger monteret ved atommodellering af begge proteiner ved hjælp af modeller udviklet af var i fremragende overensstemmelse med de eksperimentelle NSE-data. Resultaterne viste, at langsommere dynamik observeret ved længere furriertider kan tilskrives de overordnede translationelle og rotationsdiffusionsprocesser, mens dynamikken observeret på de korte tidsskalaer kan tilskrives dynamikken i proteindomæner. En vigtig ting at huske er behovet for velforberedte og rene prøver til NSE-målinger.En god prøve for et Spin Echo har et flip-forhold højere end tre, hvilket er forholdet mellem sammenhængende og usammenhængende spredning af prøven. Også under prøveforberedelse og prøveindlæsning i NSE-cellerne skal prøveopløsningen holdes sikker og fri for kemisk eller biologisk krydskontaminering. Af sikkerhedsmæssige årsager bør indgangen i spektrometerkabinettet kun forsøges, efter at lukkeren er lukket, og der er givet yderligere en halv times tid til strålingskøling af kabinettet.Småvinklet neutronspredning anbefales til at vurdere formen og strukturen af proteiner i en koncentreret opløsning. Det kan gøres før eller parallelt med NSE-eksperimentet. Yderligere metoder som dynamisk lysspredning og viskositetsmålinger giver information om translationel diffusion og hydrodynamikinteraktion inden for den koncentrerede proteinopløsning og anbefales også.

Research

JoVE Journal

Engineering

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Echo Particle Image Velocimetry

Echo Particle Billede Velocimetri

The transport of mass, momentum, and energy in fluid flows is ultimately determined by spatiotemporal distributions of the fluid velocity field.1 ...

Angle-resolved Photoemission Spectroscopy At Ultra-low Temperatures

Vinkel-løst photoemission spektroskopi ved ekstremt lave temperaturer

The physical properties of a material are defined by its  electronic structure. Electrons in solids are characterized by energy (&omega;)  and momentum ...

Gradient Echo Quantum Memory in Warm Atomic Vapor

Gradient Echo Quantum Hukommelse i Warm Atomic Vapor

Gradient  echo memory (GEM) is a protocol for storing optical quantum states of light in  atomic ensembles. The primary motivation for such a technology ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Måling Materiale Mikrostruktur Under Flow Brug 1-2 Plane Flow-Small Angle neutronspredning

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Using Neutron Spin Echo Resolved Grazing Incidence Scattering to Investigate Organic Solar Cell Materials

Brug Neutron Spin Echo løst græsning Incidens Scattering at undersøge organiske solcellematerialer

The spin echo resolved grazing incidence scattering (SERGIS) technique has been used to probe the length-scales associated with irregularly shaped ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Hurtig Imaging teknik til at undersøge Drop Impact Dynamics af ikke-newtonske væsker

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Proton Transfer og proteinkonformation Dynamics i Lysfølsomme Proteiner af Time-løst Step-scan Fourier-transform infrarød spektroskopi

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

In Situ Neutron pulverdiffraktion Brug Skræddersyede lithium-ion batterier

Li-ion batteries are widely used in portable electronic devices and are considered as promising candidates for higher-energy applications such as electric ...

Free-form Light Actuators &#8212; Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Free-form Light Actuators ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Free-form Light aktuatorer - Fabrikation og Kontrol af aktivering i Mikroskopisk Scale

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are smart materials capable of reversible shape-change in response to external stimuli, and have attracted ...

Recombination Dynamics in Thin-film Photovoltaic Materials via Time-resolved Microwave Conductivity

Rekombination Dynamics i Thin-film fotovoltaiske materialer via Time-løst Microwave Ledningsevne

A method for investigating recombination dynamics of photo-induced charge carriers in thin film semiconductors, specifically in photovoltaic materials ...