Name: study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy at JoVE.com

Dit onderzoek gebruikte middelen bij de Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biology and Chemistry labs), een DOE Office of the Science User Facility beheerd door het Oak Ridge National Laboratory. Dit onderzoek maakte ook gebruik van middelen in de MLZ-FRM2-reactor Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) en de JCNS1 in Forschungszentrum Jülich GmbH, Duitsland. De auteur erkent Dr. Ralf Biehl en Dr. Andreas Stadler voor hun hulp bij het modelleren en hun bijdrage aan zowel IgG- als MBP-eiwitonderzoek, Dr. Piotr A. Żołnierczuk voor ondersteuning van NSE-gegevensreductie, Dr. Changwoo Do voor ondersteuning met SANS-metingen en Rhonda Moody en Dr. Kevin Weiss voor SNS biochemische laboratoriumondersteuning.

Het huidige werk kenmerkt twee eiwitten: een regulier humaan antilichaameiwit IgG en het intrinsiek ongeordende MBP. De gelyofiliseerde vorm van de eiwitten werd verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel).
1. Bereiding van eiwitmonsters
<ol><li>Bereid een natriumfosfaat van 50 mM + 0,1 M NaCl-buffer door de respectieve vaste reagentia in zwaar water (D2O) te wegen en op te lossen (zie materiaaltabel). Dit is het gedeu...

NSE-spectroscopie levert een uniek en gedetailleerd beeld van de dynamiek van eiwitten, die andere spectroscopische technieken niet kunnen produceren. Metingen over een uitgebreide tijdschaal bieden waarnemingen van zowel de translationele als de rotatiediffusie van de eiwitten, zoals hier gepresenteerd. De segmentale dynamica en andere interne oscillaties openbaren zich als een sterk verval van de coherente verstrooiingsfunctie S(Q, t) op een korte tijdschaal en zijn goed gescheiden van de algehele diffusionale...

Indringende dynamiek van zachte materie met neutronen Het onderzoeken van de dynamische eigenschappen van eiwitten en peptiden is een belangrijk onderdeel van biofysisch onderzoek, en er bestaan tegenwoordig veel goed ontwikkelde methoden om toegang te krijgen tot een breed scala aan energielandschappen1. Het relateren van de experimenteel onthulde dynamiek van de eiwitten aan hun biologische functie is een veel moeilijkere taak, waarvoor complexe wiskundige modellen en computerondersteunde dynamicasimulaties nodig zijn. Het belang van neutronenspectroscopie voor de analyse van eiwitbewegingen is benadrukt in verschillende goed ontvangen en algemeen erkende studies 1,2,3,4,5. Alvorens het diverse energielandschap van interne eiwitdynamica te verkennen, is een kort overzicht nodig van de dynamische processen in zachte materie en hoe neutronen er toegang toe kunnen krijgen.
De gevoeligheid van neutronen voor isotopische configuratie en het type interacties dat ze vertonen met zachte materie maakt neutronenverstrooiing een van de meest veelzijdige onderzoekstechnieken6. Er is een breed spectrum van correlatielengteschalen en correlatietijden waartoe neutronen toegang hebben, van nucleaire excitaties en atomaire trillingen tot collectieve bewegingen en langzame ontspanningsprocessen zoals isotrope rotaties en diffusieve bewegingen. Bij het onderzoeken van de verstrooide neutronen op hun energieoverdracht kunnen drie hoofdinteracties worden onderscheiden: de elastische verstrooiing, waarbij er geen energie-uitwisseling plaatsvindt tussen inkomend neutron en deeltje in het monster; de inelastische verstrooiing, met een grote, kwantificeerbare energie-uitwisseling tussen neutron en deeltje; en het eigenaardige geval van quasi-elastische verstrooiing dat een zeer kleine energieoverdracht aanduidt in vergelijking met de invallende neutronenenergie 1,7. Deze interacties geven nauwkeurige informatie over het onderzochte materiaal en vormen de theoretische basis van een breed scala aan neutronenverstrooiingstechnieken.
Bij elastische verstrooiing registreert de detector de richtingen van de neutronen als een diffractiepatroon, dat de positie van de monsteratomen ten opzichte van elkaar weergeeft. Informatie over de correlaties van atomaire posities wordt verkregen (d.w.z. geïntegreerde intensiteit S(Q) met betrekking tot de impulsoverdracht Q, die alleen betrekking heeft op structurele informatie). Dit principe vormt de basis van neutronendiffractie8.
Complexiteit ontstaat wanneer de energieoverdracht niet langer nul is als gevolg van excitaties en interne fluctuaties in het monstermateriaal. Dit vormt de basis van neutronenspectroscopie, waarbij de verstrooide neutronen worden onderzocht als functie van zowel de energieoverdracht E als de impulsoverdracht Q. Dynamische en structurele informatie wordt verkregen. Neutronenspectroscopie meet dezelfde geïntegreerde intensiteit S(Q) voor energieoverdracht (d.w.z. snelheidsverandering van de neutronen als gevolg van monsterverstrooiing, S(Q,ω) = S(Q, E), die ook wel de dynamische structuurfactor wordt genoemd)9.
Voor het berekenen van de verstrooiing van een materiaal is het adequater om de paarcorrelatiefunctie 7,10 te gebruiken. In het geval van diffractie geeft de statische paarcorrelatiefunctie G(r) de kans om het centrum van een deeltje op een bepaalde afstand r van het centrum van een ander deeltje te vinden. De spectroscopie generaliseert de statische paarcorrelatiefunctie en neemt energie/ frequentie / tijd op in de verstrooiingsvergelijking. De paarcorrelatiefunctie G(r) wordt een functie van tijd G(r, t), die kan worden ontleed in een afzonderlijke atoompaarcorrelatiefunctie GD(r, t) en een zelfcorrelatiefunctie GS(r, t). Deze beschrijven twee soorten correlaties: paar-gecorreleerde bewegingen van atomen die de coherente verstrooiing regelen, en zelfcorrelatie die de onsamenhangende verstrooiing regelt10.
Coherente verstrooiing is de verstrooiing van "het gemiddelde" en is afhankelijk van de relatieve fase van de verstrooide golven. In het verstrooiingsregime met een kleine hoek interfereren de verstrooide neutronengolven uit verschillende verstrooiingscentra (verschillende atomen) constructief (hebben vergelijkbare fasen) en de collectieve beweging van de atomen wordt waargenomen met een sterke intensiteitsverbetering. Coherente verstrooiing beschrijft in wezen de verstrooiing van een enkel neutron uit alle kernen in het monster10.
Wanneer er geen constructieve interferentie optreedt tussen de verstrooide neutronengolven uit verschillende centra, wordt een enkel atoom in de tijd gevolgd en wordt de zelfcorrelatie tussen de positie van het atoom op tijdstip t = 0 en hetzelfde atoom op tijdstip t waargenomen. Zo gaat de informatie over de relatieve posities van atomen verloren en ligt de focus alleen op lokale fluctuaties. Verstrooiing door lokale fluctuaties regeert onsamenhangende verstrooiing. Onsamenhangende verstrooiing is isotroop, draagt bij aan het achtergrondsignaal en degradeert de signaal-naar-ruis 10,11.
Door al het bovenstaande te combineren, onderscheiden we vier belangrijke neutronenverstrooiingsprocessen10: (1) elastisch coherent (meet de correlaties van atomaire posities), (2) inelastisch coherent (meet collectieve bewegingen van atomen), (3) elastische onsamenhangende (draagt bij aan de achtergrond, vermindert de verstrooiingsintensiteit door Debye-Waller-factor (DWF) en meet elastische onsamenhangende structuurfactor (EISF), waarbij de geometrie van diffusieve bewegingen in beperkte geometrie wordt beschreven, en (4) inelastisch onsamenhangend (meet de dynamiek van één atoom en zelfcorrelatie).
Dynamische processen waartoe neutronen in de biologie toegang hebben, variëren van de demping van laagfrequente atomaire en moleculaire trillingen, de interactie van oplosmiddelmoleculen met biooppervlakken en diffusieprocessen in de hydratatielaag van macromoleculen en beperkte geometrie, tot translatie-, rotatie- en tuimelende diffusieve bewegingen op korte afstand, en eiwitdomeinen en allosterische bewegingen1 . De grote diversiteit aan neutronenmethoden en -instrumenten voor het meten van eiwitdynamica is gebaseerd op hoe de achromatisatie van de invallende of uitgaande neutronenbundel wordt bereikt en hoe de energieanalyse van de verstrooide neutronen wordt uitgevoerd. Van drie-as tot time-of-flight, backscattering en spin-echo spectrometers, men kan dynamische processen verkennen met karakteristieke tijden tussen 1 x 10-14 s en 1 x 10-6 s (femtoseconden tot microseconden)12.
Oak Ridge National Laboratory, met zijn twee gerenommeerde neutronenbronnen, de Spallation Neutron Source - SNS13 en de High Isotope Flux Reactor - HFIR14, heeft een van de beste suites van spectrometers voor het onderzoeken van dynamica in biomaterialen. Enkele van de meest sprekende voorbeelden zijn het gebruik van de koude neutronenhakspectrometer (CNCS) bij SNS15 om de dynamische verstoring van hydratatiewater rond groen fluorescerend eiwit in oplossing16 of de sub-picoseconde collectieve trillingen van verschillende eiwittente onderzoeken 17. Een terugkerend probleem van inelastisch neutronenverstrooiingsonderzoek is dat sommige biologische processen te traag zijn om te worden waargenomen. Zonder extreme opstellingen die leiden tot een enorm verlies van neutronenintensiteit, zijn time-of-flight spectrometers beperkt tot een energieresolutie van 10 μeV, wat overeenkomt met een maximale tijdschaal van ~ 200 ps10,11. Dit is niet voldoende om grootschalige bewegingen in eiwitten waar te nemen. Daarom zijn instrumenten met een hogere energieresolutie zoals de backscattering spectrometers vaak nodig. Het combineren van de time-of-flight en backscattering-technieken is krachtig gebleken voor het onderzoeken van de verandering in interne dynamiek van Cytochrome P450cam (CYP101), een enzym dat de hydroxylering kamfer18 katalyseert.
Microscopische diffusiviteit gemeten door de backscattering spectrometer op SNS-BASIS19 was verrassend goed gedefinieerd en kon worden gescheiden in de diffusiviteit van water (hydratatie, cytoplasmatisch en bulkachtig water) en de diffusiviteit van celbestanddelen in planaire platwormen, het eerste levende dier dat werd bestudeerd door neutronenverstrooiing20 . Backscattering is een spectroscopische techniek met hoge resolutie, maar het is ook beperkt tot meerdere μeV = enkele nanoseconden, terwijl de langzame dynamiek in biomaterialen zich ook manifesteert als de overlevingstijd van correlatie tussen atomaire positie of spinoriëntaties (bijvoorbeeld ontspanningsprocessen, die regelmatig plaatsvinden in het tijdsbereik van tien tot honderden nanoseconden).
Neutronenspinechospectroscopie (NSE) is de enige neutronenverstrooiingstechniek die zo'n hoge resolutie bereikt. In tegenstelling tot andere neutronentechnieken vereist NSE geen achromatisatie van de bundel, omdat het de kwantummechanische fase van de neutronen gebruikt, wat hun magnetische momenten zijn. De manipulatie van magnetische momenten maakt het gebruik van een brede neutronenbundelgolflengteverdeling mogelijk, terwijl de techniek gevoelig is voor zeer kleine neutronensnelheidsveranderingen in de orde van 1 x 10-4. NSE is met succes gebruikt om de langzame dynamiek van eiwitten in oplossing voor veel eiwitten te onderzoeken. Onder deze vele pioniersstudies erkennen we de studie van de segmentale flexibiliteit van varkensimmunoglobuline21; de gekoppelde domeinbewegingen in Taq polymerase22; de domeinbewegingen in het tetrameer van gistalcoholdehydrogenase23; de verandering van conformatie in fosfoglyceraatkinase op substraatbinding3; de activering van domeinbewegingen en de dynamische voortplanting van allosterische signalen in de Na+/H+ exchange regulatory cofactor 1 (NHERF1) eiwit 4,24,25; de dynamiek van een compacte toestand van mercurische ionenreductase26; en de diffusie van hemoglobine in rode bloedcellen27. Twee meer recente studies in eiwitdynamica hebben de flexibiliteit van humaan antilichaam Immunoglobuline G (IgG) als een entropische lenteblootgelegd 28 en de kenmerken van oplosmiddelbijdrage aan de dynamiek van intrinsiek ongeordend myeline-basiseiwit (MBP)5.
In dit artikel worden de basisprincipes van NSE uitgelegd, de meerdere voorbereidende methoden die worden aanbevolen voor een grondig eiwitdynamica-onderzoek, evenals de methodologie en het experimentele protocol voor NSE-gegevensverzameling bij de NSE-spectrometer bij SNS, SNS-NSE. Het protocol karakteriseert twee eiwitten: IgG, een regulier menselijk antilichaameiwit, en het intrinsiek ongeordende eiwit MBP. De biofysische implicaties, de onderzoeksrelevantie van de voorbeelden en de beperkingen van de techniek worden kort besproken.
NSE-spectroscopie, de methode voor langzame dynamicametingen NSE is een gepolariseerde techniek die de neutronentijd van de vlucht gebruikt om de uitwisseling van energie (verlies van polarisatie) te meten als gevolg van de quasi-elastische interactie tussen neutronen en atomen in een monster. In de kern van NSE-spectroscopie liggen twee basisprincipes: (1) het vermogen van de neutronenspin om in het magnetisch veld te precesseren met een frequentie die evenredig is met de magnetische sterkte <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61862/61862eq01.jpg" style="margin: auto;">, namelijk de Larmor-frequentie29, en (b) de spin-echo of Hann-echo, die de manipulatie en heroriëntatie van het polarisatiesignaal vertegenwoordigt bij het toepassen van een reeks radiofrequente pulsen30.
De basisprincipes van het NSE-proces kunnen worden samengevat in een paar eenvoudige stappen 6,11 met behulp van figuur 1. (1) De neutronenbundel geproduceerd door de bron (positie 1) is gepolariseerd (positie 2), geleid en getransporteerd (positie 3) en komt aan bij de ingang van de NSE-spectrometer, waar deze 90° wordt gedraaid door de eerste pi-halve flipper (positie 4). (2) De gepolariseerde bundel (bijv. magnetische neutronenmomenten) wordt loodrecht op de magnetische veldlijnen van de eerste magneet (eerste precessiezone, positie 5) en begint te precesseren. (3) Aan het einde van de magneet accumuleren neutronenspins een bepaalde precessiehoek die evenredig is met de magnetische veldsterkte en de tijd van de vlucht die erin wordt doorgebracht (in principe omgekeerd evenredig met de neutronensnelheid). De individuele neutronensnelheden worden gecodeerd binnen hun precessiehoek aan het einde van de eerste precessiezone. (4) Dicht bij de monsterpositie keert de pi-flipper (positie 6) de oriëntatie van de spin met 180° om, waardoor het teken van de precessiehoek verandert. (5) De neutronen interageren met de moleculen van het monster (positie 7) en raken verstrooid. (6) De verstrooide neutronen komen binnen en precesseren in de tweede precessiezone (positie 8), maar worden omgekeerd georiënteerd. (7) Een andere pi-halve flipper (positie 9) wordt gebruikt om de oriëntatie van de spin loodrecht op de horizontale richting te draaien. Dit zal de precessie stoppen, waardoor de precessiehoek φ wordt vertaald in polarisatie evenredig met cos(φ). (8) De analysator (positie 10) selecteert de neutronen op basis van één oriëntatie. Als de interactie met het monster elastisch is, zal de snelheid van het neutron niet veranderen. De neutronen zullen een identieke hoeveelheid tijd doorbrengen met vliegen in de eerste en tweede precessiezones en de geaccumuleerde precessiehoeken zijn volledig hersteld. De volledige polarisatie wordt hersteld op de detector (positie 11) als een echo van de oorspronkelijke polarisatie (d.w.z. spin-echo). (9) In NSE is de verstrooiing echter quasi-elastisch, zodat een kleine energie-uitwisseling tussen neutronen en monstermoleculen leidt tot verschillende neutronensnelheden na verstrooiing door het monster. Door de verschillende snelheden zullen de neutronen een extra tijd door de tweede precessiezone vliegen en hun precessiehoek niet goed hebben hersteld. Een gedeeltelijke polarisatie wordt op de detector opgehaald en het verlies van polarisatie als gevolg van spinrelaxatie is evenredig met de cos-Fourier-transformatie van de spectrale functie S(Q, ω), de tussenliggende verstrooiingsfunctie F(Q, t). (10) De tijdparameter van de functie F(Q, t) is evenredig met de magnetische veldsterkte van de precessie. Het scannen van het verlies van polarisatie als functie van de magnetische veldsterkte levert daarom een ontspanningsfunctie op die afhankelijk is van de dynamische processen in het monster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig01.jpg"> Figuur 1: Foto van de NSE spectrometer bij SNS (SNS-NSE) en neutronenvliegpad schematisch met de belangrijkste functionele componenten. Van rechts naar links: 1 = neutronenbron; 2 = choppers-bender-polarisator-secundair sluitersysteem; 3 = balktransportgeleiders; 4 = pi/2 flipper voor de eerste 90° spin-turn; 5 = eerste precessiezone; 6 = pi flipper voor 180° spin-turn; 7 = monstergebied en monsteromgeving (hier wordt de cryo-oven getoond); 8 = tweede precessiezone; 9 = pi/2 flipper voor tweede 90° spin-turn; 10 = analyser; 11 = detector. (Merk op dat delen van 3, evenals 2 en 1, zich achter de blauwe muur binnen de afscherming bevinden; de choppers worden vervangen door een snelheidskeuzeschakelaar voor reactorgebaseerde NSE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine MBP protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1891</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O - heavy water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 151882</td>
			<td>liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionized water</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>for washing / cleanning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS instrument</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>dynamic light scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic scattering standards</td>
			<td>SNS-NSE, ORNL</td>
			<td>-</td>
			<td>Al2O3&#160; and Graphite powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>65350-M</td>
			<td>70% ethanol for cleaning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWS-2 instrument</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle neutron instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquinox dish detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>-</td>
			<td>Phosphate-free liquid lab glassware cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9390</td>
			<td>disodium phosphate heptahydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9888</td>
			<td>sodium chloride salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. S9638</td>
			<td>monosodium phosphate monohydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Catalog number:&#160;ND-2000</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutron alignment camera</td>
			<td>NeutronOptics, Grenoble</td>
			<td>NOG210222</td>
			<td>100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - wax parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td>
			<td>all-purpose laboratory film in cardboard dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-J-NSE Spectrometer</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SasView</td>
			<td>https://www.sasview.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXSpace, Anton Paar instrument</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle x-ray instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88400-88405</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS Remote Analysis Cluster</td>
			<td>Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)</td>
			<td>https://analysis.sns.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS-NSE spectrometer</td>
			<td>ORNL, Oak Ridge, TN, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N.A. PN:28145-501</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Forcing System (TFS)</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Part Number 100004055</td>
			<td>sample environment equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea -d4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 176087</td>
			<td>deuterated Urea salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscometer</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>falling ball viscometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy

De activiteit en functionaliteit van de meeste menselijke lichaamseiwitten zijn gerelateerd aan configuratieveranderingen van hele subdomeinen binnen de eiwitkristalstructuur. De kristalstructuren vormen de basis voor elke berekening die de structuur of dynamiek van een eiwit beschrijft, meestal met sterke geometrische beperkingen. Deze beperkingen van de kristalstructuur zijn echter niet aanwezig in de oplossing. De structuur van de eiwitten in de oplossing kan verschillen van het kristal als gevolg van herschikkingen van lussen of subdomeinen op de pico- naar nanosecondetijdschaal (d.w.z. het interne tijdsregime van de eiwitdynamica). Het huidige werk beschrijft hoe slow motions op tijdschalen van enkele tientallen nanoseconden toegankelijk zijn met behulp van neutronenverstrooiing. In het bijzonder wordt de dynamische karakterisering van twee belangrijke menselijke eiwitten, een intrinsiek ongeordend eiwit dat een goed gedefinieerde secundaire structuur en een klassiek antilichaameiwit mist, aangepakt door neutronenspinechospectroscopie (NSE) in combinatie met een breed scala aan laboratoriumkarakteriseringsmethoden. Verdere inzichten in eiwitdomeindynamica werden verkregen met behulp van wiskundige modellering om de experimentele neutronengegevens te beschrijven en de cross-over tussen gecombineerde diffusieve en interne eiwitbewegingen te bepalen. De extractie van de interne dynamische bijdrage aan de intermediaire verstrooiingsfunctie verkregen van NSE, inclusief de tijdschaal van de verschillende bewegingen, maakt verder zicht mogelijk op de mechanische eigenschappen van afzonderlijke eiwitten en de zachtheid van eiwitten in hun bijna natuurlijke omgeving in de overvolle eiwitoplossing.

IgG-eiwit uit humaan serum en runder-MBP-eiwitten werden gereconstitueerd in hoge concentraties (~ 50 mg / ml) in D2O-base buffers. Omdat de eiwitten in hoge concentraties werden opgelost, waren de verkregen oplossingen overvolle eiwitoplossingen. De met NSE onderzochte dynamiek lijdt onder de drukke omgeving waarin de eiwitten zich bevinden (structuurfactorinteracties en hydrodynamische effecten)5,28,39. DLS werd uit...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy at JoVE.com

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van de structuur en dynamiek van twee modeleiwitten die een belangrijke rol spelen in de menselijke gezondheid. De techniek combineert bench-top biofysische karakterisering met neutronenspinechospectroscopie om toegang te krijgen tot de dynamiek op tijd- en lengteschalen die relevant zijn voor eiwitinterdomeinbewegingen.

Studie van eiwitdynamica via neutronenspinechospectroscopie

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

Het volgende protocol presenteert hoe een Neutron Spin Echo-experiment kan worden opgezet om de intermediaire verstrooiingsfunctie te meten en de dynamiek van eiwitten in oplossing te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van Neutron Spin Echo Spectroscopie is het vermogen om te kijken naar herschikking van eiwitdomeinen en subdomeinen op de pico naar nanoseconde tijdschaal; dat is het bereik van slow motions in eiwitten in hun bijna natuurlijke omgeving en in de drukke eiwitoplossing. Neutron Spin Echo is ook gevoelig voor isotopische configuratie, wat zeer specifieke en gerichte studies mogelijk maakt met behulp van contrastmatching.Inzicht in eiwitdomeindynamiek is een belangrijk onderdeel van biofysisch onderzoek in de voortdurende moeilijke taak om de domeinbewegingen van de eiwitten door te geven met hun biologische functionaliteit. Het hier gepresenteerde protocol kan over het algemeen worden toegepast op elke neutronenspinechometing die wordt uitgevoerd op de SNS-NSE-spectrometer, ongeacht uw keuze van monsters, als men binnen het rijk van zachte materiematerialen blijft. Om het experiment op te zetten, begint u met het selecteren van de dikte van de celmonsterbelasting, op basis van de concentratie van het eiwitmonster, de temperatuur die nodig is voor de meting en de beschikbare hoeveelheid oplossing.Reinig de cel met fosfaatvrij afwasmiddel, gedeïoniseerd water en 70% diethanol. Droog de cel in de heteluchtoven. Laad vier milliliter eiwitoplossing in de cel en sluit af met doppen.Gebruik wasfolie of een andere kit om de monstercellen af te dichten. Laad vier milliliter dialysebuffer in een identieke container als het eiwitmonster en sluit af. Transporteer monsters naar de balklijn.Sluit de sluiter en betreed de grot van de spectrometer. Monteer de monstercel op de aluminium monsterhouder door de schroeven en de vasthoudplaten aan te draaien. Monteer het grafietmonster en het aluminiumoxidepoedermonster in een identieke container als het eiwitmonster.Plaats dezelfde houder door deze voorzichtig in het blik van het temperatuurforceringssysteem te schuiven. Sluit het deksel van het temperatuurforceringssysteem en stel de temperatuur in op de gewenste waarde door naar het interactieve scherm van het temperatuurforceringssysteem te gaan. Monteer de neutronencamera voor de uitlijning van de monsters op de bundel.Om de neutronenspine-echospectroscopiegegevens te verzamelen, lijnt u het monster uit in de neutronenbundel met behulp van de neutronencamera en de vier onafhankelijke monsteropeningen. Open de Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy data collection software, en verzamel monsterstatistieken door defraction scans uit te voeren voor de gewenste verstrooiingshoeken en golflengte. Stel de meetparameters in op basis van de statistieken die voor elk monster zijn verzameld door de meetmacro's van de Assisting Instrument Scientist te bewerken.Begin met scannen door de protocolnaam bij de opdrachtprompt te typen en echo's voor het voorbeeld te verkrijgen. Log in op neutron sciences remote analysis cluster met de ORNL gebruikersreferenties en druk op de startsessie knop. Open in de gebruikersmap een terminalvenster en typ de opdracht software-instelling.Typ vervolgens de opdracht omgeving. Maak een map voor de gegevensreductie in de basismap en kopieer de meegeleverde scripts en macro's uit de gedeelde map. Bewerk, hernoem en sla de opgegeven reductiemacro dienovereenkomstig op.Typ drspine" bij de opdrachtprompt en druk op Enter om de softwarereductieomgeving te starten. Typ de naam van de reductiemacro in de opdrachtprompt in de softwareomgeving en druk op Enter. Bewerk het Python-script van de Assisting Instrument Scientist met de namen van de gereduceerde bestandsgegevens.Bewerk de functie die past in de meegeleverde bibliotheek. Typ de naam van het bewerkte script bij de opdrachtprompt en druk op Enter om gereduceerde NSE-gegevens te lezen, te passen en te plotten. De intermediaire verstrooiingsfunctie gemeten door NSE voor IgG- en MBP-eiwitten toont een duidelijke afwijking van een eenvoudig diffusie-achtig ontspanningsproces op de korte tijdschaal van vier jaar, wat de toegankelijkheid van eiwitinwendige dynamica door NSE aangeeft, en de behoefte aan een complexer model om de waargenomen dynamische processen te beschrijven.De resultaten van tussentijdse verstrooiingsfunctieberekeningen met atomaire modellering van beide eiwitten met behulp van modellen ontwikkeld door waren in uitstekende overeenstemming met de experimentele NSE-gegevens. De resultaten toonden aan dat langzamere dynamiek waargenomen bij langere furriertijden kan worden toegeschreven aan de algemene translationele en rotatiediffusieprocessen, terwijl de dynamiek waargenomen op de korte tijdschalen kan worden toegeschreven aan de dynamiek van eiwitdomeinen. Een belangrijk ding om te onthouden is de noodzaak van goed voorbereide en schone monsters voor NSE-metingen.Een goed monster voor een Spin Echo heeft een flip ratio hoger dan drie, wat de verhouding is tussen coherente en onsamenhangende verstrooiing van het monster. Ook tijdens de monstervoorbereiding en het laden van monsters in de NSE-cellen moet de monsteroplossing veilig en vrij van chemische of biologische kruisbesmetting worden bewaard. Om veiligheidsredenen mag de ingang in de spectrometerbehuizing alleen worden geprobeerd nadat de sluiter is gesloten en is een extra half uur tijd toegestaan voor stralingskoeling van de behuizing.Small-Angle Neutron Scattering wordt aanbevolen om de vorm en de structuur van eiwitten in een geconcentreerde oplossing te beoordelen. Het kan voor of parallel met het NSE-experiment. Aanvullende methoden zoals dynamische lichtverstrooiing en viscositeitsmetingen geven informatie over de translatiediffusie en de hydrodynamische interactie binnen de geconcentreerde eiwitoplossing, en worden ook aanbevolen.

Research

JoVE Journal

Engineering

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Echo Particle Image Velocimetry

The transport of mass, momentum, and energy in fluid flows is ultimately determined by spatiotemporal distributions of the fluid velocity field.1 ...

Angle-resolved Photoemission Spectroscopy At Ultra-low Temperatures

Hoekopgeloste foto-emissie spectroscopie bij ultralage temperaturen

The physical properties of a material are defined by its  electronic structure. Electrons in solids are characterized by energy (&omega;)  and momentum ...

Gradient Echo Quantum Memory in Warm Atomic Vapor

Gradient  echo memory (GEM) is a protocol for storing optical quantum states of light in  atomic ensembles. The primary motivation for such a technology ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Meten Materiaal microstructuur Onder Flow Met behulp van 1-2 Plane Flow-Lage hoek neutronenverstrooiing

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Using Neutron Spin Echo Resolved Grazing Incidence Scattering to Investigate Organic Solar Cell Materials

Neutron Spin Echo Resolved Grazing Incidence Scattering gebruiken om organische zonnecelmaterialen te onderzoeken

The spin echo resolved grazing incidence scattering (SERGIS) technique has been used to probe the length-scales associated with irregularly shaped ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Snelle beeldvormende techniek om te studeren Drop Impact Dynamiek van niet-Newtoniaanse vloeistoffen

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Proton Transfer en eiwitconformatie Dynamiek in lichtgevoelige eiwitten door Tijdsgeresolveerde Step-scan Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

In Situ Neutron poederdiffractie behulp Maatwerk Lithium-ion batterijen

Li-ion batteries are widely used in portable electronic devices and are considered as promising candidates for higher-energy applications such as electric ...

Free-form Light Actuators &#8212; Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Free-form Light Actuators ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Free-form Light Actuators - Fabricage en Controle van de Aandrijving in microscopische schaal

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are smart materials capable of reversible shape-change in response to external stimuli, and have attracted ...

Recombination Dynamics in Thin-film Photovoltaic Materials via Time-resolved Microwave Conductivity

Recombinatie Dynamiek in dunne-film Photovoltaic Materials via Tijdopgeloste Magnetron geleidbaarheid

A method for investigating recombination dynamics of photo-induced charge carriers in thin film semiconductors, specifically in photovoltaic materials ...