Name: study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00
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Cette recherche a utilisé les ressources de la source de neutrons de spallation (BL-15, BL-6, laboratoires de biologie et de chimie), un bureau du DOE de l’installation des utilisateurs scientifiques exploité par le laboratoire national d’Oak Ridge. Cette recherche a également utilisé les ressources du réacteur MLZ-FRM2 garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) et du JCNS1 de Forschungszentrum Jülich GmbH, en Allemagne. L’auteur remercie le Dr Ralf Biehl et le Dr Andreas Stadler pour leur aide à la modélisation et leur contribution à la recherche sur les protéines IgG et MBP, le Dr Piotr A. Żołnierczuk pour le soutien à la réduction des données NSE, le Dr Changwoo Do pour le soutien avec les mesures SANS, et Rhonda Moody et le Dr Kevin Weiss pour le soutien du laboratoire de biochimie SNS.

Les présents travaux caractérisent deux protéines : une protéine d’anticorps humains IgG régulière et le MBP intrinsèquement désordonné. La forme lyophilisée des protéines a été obtenue à partir de sources commerciales (voir tableau des matériaux).
1. Préparation d’échantillons de protéines
<ol><li>Préparer un tampon de phosphate de sodium de 50 mM + 0,1 M de NaCl en pesant et en dissolvant les réactifs solides respectifs dans de l’...

La spectroscopie NSE fournit une vue unique et détaillée de la dynamique des protéines, que d’autres techniques spectroscopiques ne peuvent pas produire. Les mesures sur une longue échelle de temps fournissent des observations de la diffusion translationnelle et rotationnelle des protéines, comme présenté ici. La dynamique segmentaire et d’autres oscillations internes se révèlent comme une forte désintégration de la fonction de diffusion cohérente S(Q, t) à une courte échelle de temps et sont b...

Dynamique de sondage de la matière molle avec des neutrons L’étude des propriétés dynamiques des protéines et des peptides est une partie importante de la recherche biophysique, et de nombreuses méthodes bien développées existent aujourd’hui pour accéder à un large éventail de paysages énergétiques1. Relier la dynamique révélée expérimentalement des protéines à leur fonction biologique est une tâche beaucoup plus difficile, nécessitant des modèles mathématiques complexes et des simulations dynamiques assistées par ordinateur. L’importance de la spectroscopie neutronique pour l’analyse des mouvements des protéines a été soulignée dans plusieurs études bien reçues et largement reconnues 1,2,3,4,5. Avant d’explorer le paysage énergétique diversifié de la dynamique interne des protéines, un bref aperçu des processus dynamiques dans la matière molle et de la façon dont les neutrons peuvent y accéder est nécessaire.
La sensibilité des neutrons à la configuration isotopique et le type d’interactions qu’ils présentent avec la matière molle font de la diffusion des neutrons l’une des techniques d’investigation les plus polyvalentes6. Il existe un large spectre d’échelles de longueur de corrélation et de temps de corrélation auxquels les neutrons peuvent accéder, des excitations nucléaires et des vibrations atomiques aux mouvements collectifs et aux processus de relaxation lents comme les rotations isotropes et les mouvements diffusifs. Lors de l’étude des neutrons diffusés pour leur transfert d’énergie, trois interactions principales peuvent être distinguées: la diffusion élastique, dans laquelle il n’y a pas d’échange d’énergie entre le neutron entrant et la particule dans l’échantillon; la diffusion inélastique, avec un grand échange d’énergie quantifiable entre le neutron et la particule; et le cas particulier de la diffusion quasi-élastique qui désigne un très petit transfert d’énergie par rapport à l’énergie neutronique incidente 1,7. Ces interactions donnent des informations précises sur le matériau étudié et constituent la base théorique d’une grande variété de techniques de diffusion des neutrons.
En diffusion élastique, le détecteur enregistre les directions des neutrons sous la forme d’un motif de diffraction, qui montre la position des atomes de l’échantillon les uns par rapport aux autres. Des informations sur les corrélations des positions atomiques sont acquises (c’est-à-dire l’intensité intégrée S(Q) concernant le transfert de quantité de mouvement Q, qui se rapporte uniquement à l’information structurelle). Ce principe constitue la base de la diffractionneutronique 8.
La complexité survient lorsque le transfert d’énergie n’est plus nul en raison des excitations et des fluctuations internes du matériau de l’échantillon. Cela constitue la base de la spectroscopie neutronique, dans laquelle les neutrons diffusés sont étudiés en fonction du transfert d’énergie E et du transfert de quantité de mouvement Q. Des informations dynamiques et structurelles sont obtenues. La spectroscopie neutronique mesure la même intensité intégrée S(Q) pour le transfert d’énergie (c.-à-d. le changement de vitesse des neutrons dû à la diffusion de l’échantillon, S(Q,ω) = S(Q, E), également appelé facteur de structure dynamique)9.
Pour calculer la diffusion à partir d’un matériau, il est plus approprié d’utiliser la fonction de corrélation de paire 7,10. Dans le cas de la diffraction, la fonction de corrélation de paire statique G(r) donne la probabilité de trouver le centre d’une particule à une distance donnée r du centre d’une autre particule. La spectroscopie généralise la fonction de corrélation des paires statiques et inclut l’énergie/fréquence/temps dans l’équation de diffusion. La fonction de corrélation de paire G(r) devient une fonction de temps G(r, t), qui peut être décomposée en une fonction de corrélation de paire d’atomes distincte GD(r, t) et une fonction d’auto-corrélation GS(r, t). Ceux-ci décrivent deux types de corrélations : les mouvements d’atomes corrélés par paires qui régissent la diffusion cohérente, et l’auto-corrélation qui régit la diffusion incohérente10.
La diffusion cohérente est la diffusion à partir de « la moyenne » et dépend de la phase relative des ondes diffusées. Dans le régime de diffusion à petit angle, les ondes neutroniques diffusées à partir de différents centres de diffusion (différents atomes) interfèrent de manière constructive (ont des phases similaires), et le mouvement collectif des atomes est observé avec une forte amélioration de l’intensité. La diffusion cohérente décrit essentiellement la diffusion d’un seul neutron à partir de tous les noyaux de l’échantillon10.
Lorsqu’aucune interférence constructive ne se produit entre les ondes neutroniques diffusées de différents centres, un seul atome est suivi dans le temps, et l’auto-corrélation entre la position de l’atome au temps t = 0 et le même atome au temps t est observée. Ainsi, l’information sur les positions relatives des atomes est perdue et l’accent est mis uniquement sur les fluctuations locales. La diffusion à partir des fluctuations locales régit la diffusion incohérente. La diffusion incohérente est isotrope, contribue au signal de fond et dégrade le rapport signal-bruit10,11.
En combinant tout ce qui précède, nous distinguons quatre grands processus de diffusion de neutrons10: (1) cohérent élastique (mesure les corrélations des positions atomiques), (2) cohérent inélastique (mesure les mouvements collectifs des atomes), (3) incohérent élastique (contribue à l’arrière-plan, réduit l’intensité de diffusion par le facteur de Debye-Waller (DWF) et mesure le facteur de structure incohérente élastique (EISF), décrivant la géométrie des mouvements diffusifs en géométrie confinée, et (4) incohérent inélastique (mesure la dynamique et l’auto-corrélation d’un seul atome).
Les processus dynamiques auxquels les neutrons peuvent accéder en biologie vont de l’amortissement des vibrations atomiques et moléculaires à basse fréquence, de l’interaction des molécules de solvant avec les bio-surfaces et des processus de diffusion dans la couche d’hydratation des macromolécules et de la géométrie confinée, aux mouvements diffusifs translationnels, rotationnels et tumbling à courte portée, aux domaines protéiques et aux mouvements allostériques1 . La grande diversité des méthodes et des instruments neutroniques pour mesurer la dynamique des protéines est basée sur la façon dont l’achromatisation du faisceau de neutrons incident ou sortant est réalisée et sur la façon dont l’analyse énergétique des neutrons diffusés est effectuée. Des spectromètres à triple axe aux spectromètres à temps de vol, en passant par la rétrodiffusion et l’écho de spin, on peut explorer des processus dynamiques avec des temps caractéristiques compris entre 1 x 10-14 s et 1 x 10-6 s (femtosecondes à microsecondes)12.
Le Laboratoire national d’Oak Ridge, avec ses deux sources de neutrons renommées, la source de neutrons de spallation - SNS13 et le réacteur à flux isotopique élevé - HFIR14, possède l’une des meilleures suites de spectromètres pour étudier la dynamique des biomatériaux. Parmi les exemples les plus éloquents, citons l’utilisation du spectromètre à neutrons froids (CNCS) de SNS15 pour étudier la perturbation dynamique de l’eau d’hydratation autour de la protéine fluorescente verte dans la solution16 ou les vibrations collectives sub-picosecondes de plusieurs protéines17. Un problème récurrent des recherches sur la diffusion inélastique des neutrons est que certains processus biologiques sont trop lents pour être observés. Sans configurations extrêmes qui entraînent une énorme perte d’intensité neutronique, les spectromètres à temps de vol sont limités à une résolution d’énergie de 10 μeV, correspondant à une échelle de temps maximale d’environ 200 ps10,11. Cela ne suffit pas pour observer des mouvements à grande échelle dans les protéines. Par conséquent, des instruments avec une résolution d’énergie plus élevée comme les spectromètres à rétrodiffusion sont souvent nécessaires. La combinaison des techniques de temps de vol et de rétrodiffusion s’est avérée puissante pour étudier le changement de dynamique interne du cytochrome P450cam (CYP101), une enzyme qui catalyse l’hydroxylation camphre18.
La diffusivité microscopique mesurée par le spectromètre à rétrodiffusion de SNS-BASIS19 était étonnamment bien définie et pouvait être séparée en diffusivité de l’eau (hydratation, cytoplasmique et eau de type vrac) et en diffusivité des constituants cellulaires chez les vers plats planaires, le premier animal vivant à être étudié par diffusion neutronique20 . La rétrodiffusion est une technique spectroscopique à haute résolution, mais elle est également limitée à plusieurs μeV = plusieurs nanosecondes, tandis que la dynamique lente dans les biomatériaux se manifeste également par le temps de survie de la corrélation entre la position atomique ou les orientations de spin (par exemple, les processus de relaxation, qui se produisent régulièrement dans la gamme de temps de dix à des centaines de nanosecondes).
La spectroscopie d’écho de spin neutronique (NSE) est la seule technique de diffusion neutronique à atteindre une résolution aussi élevée. Contrairement à d’autres techniques neutroniques, NSE ne nécessite pas d’achromatisation du faisceau puisqu’il utilise la phase mécanique quantique des neutrons, qui est leurs moments magnétiques. La manipulation des moments magnétiques permet l’utilisation d’une large distribution de longueur d’onde du faisceau de neutrons, tandis que la technique est sensible à de très petits changements de vitesse des neutrons de l’ordre de 1 x 10-4. NSE a été utilisé avec succès pour étudier la dynamique lente des protéines en solution pour de nombreuses protéines. Parmi ces nombreuses études pionnières, nous reconnaissons l’étude de la flexibilité segmentaire de l’immunoglobuline21 porcine; les mouvements du domaine couplé dans la Taq polymérase22; les mouvements du domaine dans le tétramère de l’alcool déshydrogénasede levure 23; le changement de conformation dans la phosphoglycérate kinase lors de la liaison du substrat3; l’activation des mouvements du domaine et la propagation dynamique des signaux allostériques dans la protéine 4,24,25 du cofacteur régulateur de l’échange Na+/H+ (NHERF1); la dynamique d’un état compact de l’ion mercurique réductase26; et la diffusion de l’hémoglobine dans les globules rouges27. Deux études plus récentes sur la dynamique des protéines ont exposé la flexibilité de l’anticorps humain Immunoglobuline G (IgG) en tant que source entropique28 et les caractéristiques de la contribution du solvant à la dynamique de la protéine de base de la myéline intrinsèquement désordonnée (MBP)5.
Le présent article explique les principes de base de la NSE, les multiples méthodes préparatoires recommandées pour une étude approfondie de la dynamique des protéines, ainsi que la méthodologie et le protocole expérimental pour l’acquisition de données NSE au spectromètre NSE du SNS, SNS-NSE. Le protocole caractérise deux protéines : l’IgG, une protéine d’anticorps humains ordinaire, et la protéine MBP intrinsèquement désordonnée. Les implications biophysiques, la pertinence des exemples pour la recherche et les limites de la technique sont brièvement discutées.
Spectroscopie NSE, la méthode pour les mesures de dynamique lente NSE est une technique polarisée qui utilise le temps de vol des neutrons pour mesurer l’échange d’énergie (perte de polarisation) dû à l’interaction quasi-élastique entre les neutrons et les atomes dans un échantillon. Au cœur de la spectroscopie NSE se trouvent deux principes de base : (1) la capacité du spin neutronique à précéder dans le champ magnétique avec une fréquence proportionnelle à la force <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61862/61862eq01.jpg" style="margin: auto;">magnétique, à savoir la fréquence de Larmor29, et (b) l’écho de spin ou écho de Hann, représentant la manipulation et le recentrage du signal de polarisation lors de l’application d’une série d’impulsions de radiofréquence30.
Les bases du processus NSE peuvent être résumées en quelques étapes simples 6,11 à l’aide de la figure 1. (1) Le faisceau de neutrons produit par la source (position 1) est polarisé (position 2), guidé et transporté (position 3), et arrive à l’entrée du spectromètre NSE, où il est tourné de 90° par la première nageoire pi-half (position 4). (2) Le faisceau polarisé (p. ex., les moments magnétiques neutroniques) devient perpendiculaire aux lignes de champ magnétique du premier aimant (première zone de précession, position 5) et commence à précession. (3) À l’extrémité de l’aimant, les spins neutroniques accumulent un certain angle de précession proportionnel à l’intensité du champ magnétique et au temps de vol passé à l’intérieur (essentiellement inversement proportionnel à la vitesse du neutron). Les vitesses individuelles des neutrons sont codées dans leur angle de précession à la fin de la première zone de précession. (4) Près de la position de l’échantillon, le pi-flipper (position 6) inverse l’orientation du spin de 180°, modifiant le signe de l’angle de précession. (5) Les neutrons interagissent avec les molécules de l’échantillon (position 7) et se dispersent. (6) Les neutrons diffusés pénètrent et précèdent dans la deuxième zone de précession (position 8) mais deviennent orientés vers l’inverse. (7) Une autre nageoire pi-half (position 9) est utilisée pour faire pivoter l’orientation du spin de perpendiculaire à la direction horizontale. Cela arrêtera la précession, traduisant l’angle de précession φ en polarisation proportionnelle au cos(φ). (8) L’analyseur (position 10) sélectionne les neutrons en fonction d’une orientation. Si l’interaction avec l’échantillon est élastique, la vitesse du neutron ne changera pas. Les neutrons passeront un temps identique à voler dans les première et deuxième zones de précession, et les angles de précession accumulés sont entièrement récupérés. La polarisation complète est restaurée sur le détecteur (position 11) en tant qu’écho de la polarisation d’origine (c’est-à-dire spin-écho). (9) Cependant, dans NSE, la diffusion est quasi-élastique, de sorte qu’un petit échange d’énergie entre les neutrons et les molécules d’échantillon conduit à des vitesses de neutrons différentes après diffusion par l’échantillon. En raison des différentes vitesses, les neutrons passeront un temps supplémentaire à voler à travers la deuxième zone de précession et n’auront pas correctement récupéré leur angle de précession. Une polarisation partielle est récupérée sur le détecteur, et la perte de polarisation due à la relaxation du spin est proportionnelle à la transformation de Cos-Fourier de la fonction spectrale S(Q, ω), la fonction de diffusion intermédiaire F(Q, t). (10) Le paramètre de temps de la fonction F(Q, t) est proportionnel à l’intensité du champ magnétique de précession. Le balayage de la perte de polarisation en fonction de l’intensité du champ magnétique donne donc une fonction de relaxation qui dépend des processus dynamiques au sein de l’échantillon.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig01.jpg"> Figure 1 : Photographie du spectromètre NSE au SNS (SNS-NSE) et schéma de trajectoire de vol des neutrons avec les composants fonctionnels les plus importants. De droite à gauche : 1 = source de neutrons ; 2 = choppers-bender-polarizer-système d’obturateur secondaire; 3 = guides de transport de faisceau; 4 = pi/2 flipper pour le premier spin-turn à 90° ; 5 = première zone de précession; 6 = pi flipper pour un spin-turn de 180°; 7 = surface de l’échantillon et environnement de l’échantillon (ici, le cryo-four est montré); 8 = deuxième zone de précession; 9 = pi/2 flipper pour le deuxième spin-turn à 90° ; 10 = analyseur; 11 = détecteur. (Notez que les parties de 3, ainsi que 2 et 1, sont situées derrière le mur bleu à l’intérieur du blindage; les hachoirs sont remplacés par un sélecteur de vitesse pour le NSE basé sur un réacteur). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine MBP protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1891</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O - heavy water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 151882</td>
			<td>liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionized water</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>for washing / cleanning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS instrument</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>dynamic light scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic scattering standards</td>
			<td>SNS-NSE, ORNL</td>
			<td>-</td>
			<td>Al2O3&#160; and Graphite powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>65350-M</td>
			<td>70% ethanol for cleaning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWS-2 instrument</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle neutron instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquinox dish detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>-</td>
			<td>Phosphate-free liquid lab glassware cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9390</td>
			<td>disodium phosphate heptahydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9888</td>
			<td>sodium chloride salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. S9638</td>
			<td>monosodium phosphate monohydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Catalog number:&#160;ND-2000</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutron alignment camera</td>
			<td>NeutronOptics, Grenoble</td>
			<td>NOG210222</td>
			<td>100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - wax parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td>
			<td>all-purpose laboratory film in cardboard dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-J-NSE Spectrometer</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SasView</td>
			<td>https://www.sasview.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXSpace, Anton Paar instrument</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle x-ray instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88400-88405</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS Remote Analysis Cluster</td>
			<td>Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)</td>
			<td>https://analysis.sns.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS-NSE spectrometer</td>
			<td>ORNL, Oak Ridge, TN, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N.A. PN:28145-501</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Forcing System (TFS)</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Part Number 100004055</td>
			<td>sample environment equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea -d4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 176087</td>
			<td>deuterated Urea salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscometer</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>falling ball viscometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy

L’activité et la fonctionnalité de la plupart des protéines du corps humain sont liées à des changements de configuration de sous-domaines entiers au sein de la structure cristalline de la protéine. Les structures cristallines constituent la base de tout calcul qui décrit la structure ou la dynamique d’une protéine, la plupart du temps avec de fortes restrictions géométriques. Cependant, ces restrictions de la structure cristalline ne sont pas présentes dans la solution. La structure des protéines dans la solution peut différer de celle du cristal en raison de réarrangements de boucles ou de sous-domaines sur l’échelle de temps pico à nanoseconde (c’est-à-dire le régime temporel de la dynamique interne des protéines). Le présent travail décrit comment les ralentis sur des échelles de temps de plusieurs dizaines de nanosecondes peuvent être accessibles en utilisant la diffusion des neutrons. En particulier, la caractérisation dynamique de deux protéines humaines majeures, une protéine intrinsèquement désordonnée qui n’a pas de structure secondaire bien définie et une protéine d’anticorps classique, est traitée par spectroscopie d’écho de spin neutronique (NSE) combinée à un large éventail de méthodes de caractérisation en laboratoire. D’autres connaissances sur la dynamique du domaine protéique ont été obtenues à l’aide de la modélisation mathématique pour décrire les données expérimentales sur les neutrons et déterminer le croisement entre les mouvements diffusifs et internes combinés des protéines. L’extraction de la contribution dynamique interne à la fonction de diffusion intermédiaire obtenue à partir de NSE, y compris l’échelle de temps des différents mouvements, permet une vision plus approfondie des propriétés mécaniques des protéines uniques et de la douceur des protéines dans leur environnement presque naturel dans la solution protéique encombrée.

Les protéines IgG du sérum humain et des protéines MBP bovines ont été reconstituées à des concentrations élevées (~50 mg/mL) dans des tampons D2O-base. Comme les protéines ont été dissoutes à des concentrations élevées, les solutions obtenues étaient des solutions protéiques encombrées. Les dynamiques étudiées à l’aide de NSE souffrent de l’environnement surpeuplé dans lequel résident les protéines (interactions des facteurs de structure et effets hydrodynamiques)...

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Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Le présent protocole décrit des méthodes pour étudier la structure et la dynamique de deux protéines modèles qui jouent un rôle important dans la santé humaine. La technique combine la caractérisation biophysique de paillasse avec la spectroscopie d’écho de spin neutronique pour accéder à la dynamique aux échelles de temps et de longueur pertinentes pour les mouvements interdomaines des protéines.

Étude de la dynamique des protéines par spectroscopie d’écho de spin neutronique

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

Le protocole suivant présente comment mettre en place une expérience Neutron Spin Echo pour mesurer la fonction de diffusion intermédiaire et étudier la dynamique des protéines en solution. Le principal avantage de la spectroscopie d’écho de spin neutronique est sa capacité à examiner le réarrangement des domaines et des sous-domaines protéiques sur l’échelle de temps pico à la nanoseconde; qui est la gamme de ralentis dans les protéines dans leur environnement presque naturel, et dans la solution protéique encombrée. Neutron Spin Echo est également sensible à la configuration isotopique, ce qui permet des études très spécifiques et ciblées utilisant l’appariement de contraste.Les connaissances sur la dynamique du domaine protéique constituent une partie importante de la recherche biophysique dans la tâche difficile en cours de relayer les mouvements du domaine des protéines avec leur fonctionnalité biologique. Le protocole présenté ici peut être généralement appliqué à toute mesure de l’écho de spin neutronique effectuée au spectromètre SNS-NSE, quel que soit votre choix d’échantillons, si l’on reste dans le domaine des matériaux de matière molle. Pour mettre en place l’expérience, commencez par sélectionner l’épaisseur de la charge de l’échantillon cellulaire, en fonction de la concentration de l’échantillon de protéines, de la température nécessaire à la mesure et de la quantité de solution disponible.Nettoyez la cellule avec du détergent à vaisselle sans phosphate, de l’eau désionisée et du diéthanol à 70%. Sécher la cellule dans le four à convection. Chargez quatre millilitres de solution protéique dans la cellule et fermez avec des bouchons.Utilisez un film de cire ou tout autre scellant pour sceller les cellules de l’échantillon. Chargez quatre millilitres de tampon de dialyse dans un récipient identique à celui de l’échantillon de protéines et scellez. Transporter les échantillons jusqu’à la ligne de faisceau.Fermez l’obturateur et entrez dans la zone de la grotte de l’enceinte du spectromètre. Montez la cellule d’échantillon sur le porte-échantillon en aluminium en serrant les vis et les plaques de maintien. Montez l’échantillon de graphite et l’échantillon de poudre d’oxyde d’aluminium chargés dans un récipient identique à celui de l’échantillon de protéines.Placez le même support en le faisant glisser doucement dans la boîte du système de forçage de température. Fermez le couvercle du système de forçage de température et réglez la température à la valeur souhaitée en accédant à l’écran interactif du système de forçage de température. Montez la caméra à neutrons pour l’alignement des échantillons sur le faisceau.Pour collecter les données de spectroscopie d’écho de spin neutronique, alignez l’échantillon dans le faisceau de neutrons à l’aide de la caméra à neutrons et des quatre ouvertures d’échantillon indépendantes. Ouvrez la source de neutrons de spallation, le logiciel de collecte de données neutron-spin echo spectroscopy et collectez des statistiques d’échantillons en exécutant des analyses de déflation pour les angles de diffusion et la longueur d’onde souhaités. Configurez les paramètres de mesure en fonction des statistiques collectées pour chaque échantillon en éditant les macros de mesure fournies par le scientifique de l’instrument d’assistance.Commencez l’analyse en tapant le nom du protocole dans le prompteur de commandes et en acquérant des échos pour l’exemple. Connectez-vous au cluster Neutron Sciences Remote Analysis avec les informations d’identification de l’utilisateur ORNL et appuyez sur le bouton de lancement de la session. Dans le répertoire utilisateur, ouvrez une fenêtre de terminal et tapez la commande de configuration du logiciel.Ensuite, tapez la commande d’environnement. Créez un dossier pour la réduction des données dans le répertoire de base et copiez les scripts et macros fournis à partir du répertoire partagé. Modifiez, renommez et enregistrez la macro de réduction fournie en conséquence.Tapez drspine"à l’invite de commandes et appuyez sur Entrée pour démarrer l’environnement de réduction logicielle. Tapez le nom de la macro de réduction dans le prompteur de commandes de l’environnement logiciel, puis appuyez sur Entrée. Modifiez le script Python fourni par Assisting Instrument Scientist avec les noms des données de fichier réduites.Modifiez la fonction pour l’adapter à partir de la bibliothèque fournie. Tapez le nom du script modifié dans le prompteur de commandes, puis appuyez sur Entrée pour lire, ajuster et tracer des données NSE réduites. La fonction de diffusion intermédiaire mesurée par NSE pour les protéines IgG et MBP montre un net écart par rapport à un simple processus de relaxation de type diffusion sur la courte échelle de temps de quatre ans, indiquant l’accessibilité de la dynamique interne des protéines par NSE, et la nécessité d’un modèle plus complexe pour décrire les processus dynamiques observés.Les résultats des calculs de la fonction de diffusion intermédiaire ajustés par modélisation atomique des deux protéines à l’aide de modèles développés par étaient en excellent accord avec les données expérimentales de nSE. Les résultats ont prouvé que la dynamique plus lente observée à des temps de fourrage plus longs peut être attribuée aux processus globaux de diffusion translationnelle et rotationnelle, tandis que la dynamique observée aux courtes échelles de temps peut être attribuée à la dynamique des domaines protéiques. Une chose importante à retenir est la nécessité d’échantillons bien préparés et propres pour les mesures NSE.Un bon échantillon pour un Spin Echo a un rapport de retournement supérieur à trois, qui est le rapport entre la diffusion cohérente et incohérente de l’échantillon. De plus, pendant la préparation de l’échantillon et le chargement de l’échantillon dans les cellules NSE, la solution de l’échantillon doit être conservée en toute sécurité et exempte de toute contamination croisée chimique ou biologique. Pour des raisons de sécurité, l’entrée dans l’enceinte du spectromètre ne doit être tentée qu’après la fermeture de l’obturateur et un temps supplémentaire d’une demi-heure a été accordé pour le refroidissement par rayonnement de l’enceinte.La diffusion neutronique à petit angle est recommandée pour évaluer la forme et la structure des protéines dans une solution concentrée. Cela peut être fait avant ou en parallèle avec l’expérience NSE. Des méthodes supplémentaires telles que la diffusion dynamique de la lumière et les mesures de viscosité fournissent des informations sur la diffusion translationnelle et l’interaction hydrodynamique dans la solution protéique concentrée, et sont également recommandées.

Research

JoVE Journal

Engineering

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

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Ingénierie

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Utilisation de la diffusion de l’incidence de broutage résolue par écho de spin neutronique pour étudier les matériaux des cellules solaires organiques

The spin echo resolved grazing incidence scattering (SERGIS) technique has been used to probe the length-scales associated with irregularly shaped ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Imagerie rapide technique permettant d&#39;étudier l&#39;impact de baisse de la dynamique des fluides non-newtoniens

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Proton transfert et la conformation des protéines photosensibles dans la dynamique des protéines par résolution temporelle étape-scan à transformée de Fourier spectroscopie infrarouge

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

In Situ diffraction de poudre, l&#39;utilisation des batteries au lithium-ion sur mesure

Li-ion batteries are widely used in portable electronic devices and are considered as promising candidates for higher-energy applications such as electric ...

Free-form Light Actuators &#8212; Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Free-form Light Actuators ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Free-forme légère Actionneurs - Fabrication et contrôle des Actuation dans l&#39;échelle microscopique

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are smart materials capable of reversible shape-change in response to external stimuli, and have attracted ...

Recombination Dynamics in Thin-film Photovoltaic Materials via Time-resolved Microwave Conductivity

Recombinaison Dynamics photovoltaïques en couches minces de matériaux par résolution temporelle Micro-ondes Conductivity

A method for investigating recombination dynamics of photo-induced charge carriers in thin film semiconductors, specifically in photovoltaic materials ...