Name: study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy at JoVE.com

מחקר זה השתמש במשאבים ב-Spallation Neutron Source (מעבדות BL-15, BL-6, ביולוגיה וכימיה), משרד DOE של מתקן משתמשי המדע המופעל על ידי המעבדה הלאומית אוק רידג'. מחקר זה השתמש גם במשאבים בכור MLZ-FRM2 גרצ'ינג (KWS-2, פיניקס-J-NSE) וב-JCNS1 ב-Forschungszentrum Jülich GmbH, גרמניה. המחבר מודה לד"ר ראלף ביהל ולד"ר אנדריאס שטדלר על עזרתם במידול ותרומתם למחקר חלבוני IgG ו-MBP, לד"ר פיוטר א. ז'ולניירצ'וק לתמיכה בהפחתת נתונים של NSE, לד"ר צ'אנגוו דו על התמיכה במדידות SANS, ולרונדה מודי וד"ר קווין לתמיכה במעבדת הביוכימיה של SNS.

העבודה הנוכחית מאפיינת שני חלבונים: חלבון נוגדן אנושי רגיל IgG, ו- MBP המופרע במהותו. הצורה הליופילית של החלבונים התקבלה ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת דגימת חלבון
<ol><li>הכינו חיץ נתרן פוספט של 50 mM + 0.1 M NaCl על ידי שקילה והמסה של הריאגנטים המוצקים המתאי...

ספקטרוסקופיית NSE מספקת תצוגה ייחודית ומפורטת של הדינמיקה של חלבונים, שטכניקות ספקטרוסקופיות אחרות אינן יכולות לייצר. מדידות על פני סולם זמן ממושך מספקות תצפיות הן על הדיפוזיה התרגומית והן על הדיפוזיה הסיבובית של החלבונים, כפי שמוצג כאן. הדינמיקה הסגמנטלית ותנודות פנימיות אחרות חושפות את...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine MBP protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1891</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O - heavy water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 151882</td>
			<td>liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionized water</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>for washing / cleanning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS instrument</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>dynamic light scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic scattering standards</td>
			<td>SNS-NSE, ORNL</td>
			<td>-</td>
			<td>Al2O3&#160; and Graphite powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>65350-M</td>
			<td>70% ethanol for cleaning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWS-2 instrument</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle neutron instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquinox dish detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>-</td>
			<td>Phosphate-free liquid lab glassware cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9390</td>
			<td>disodium phosphate heptahydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9888</td>
			<td>sodium chloride salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. S9638</td>
			<td>monosodium phosphate monohydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Catalog number:&#160;ND-2000</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutron alignment camera</td>
			<td>NeutronOptics, Grenoble</td>
			<td>NOG210222</td>
			<td>100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - wax parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td>
			<td>all-purpose laboratory film in cardboard dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-J-NSE Spectrometer</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SasView</td>
			<td>https://www.sasview.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXSpace, Anton Paar instrument</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle x-ray instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88400-88405</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS Remote Analysis Cluster</td>
			<td>Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)</td>
			<td>https://analysis.sns.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS-NSE spectrometer</td>
			<td>ORNL, Oak Ridge, TN, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N.A. PN:28145-501</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Forcing System (TFS)</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Part Number 100004055</td>
			<td>sample environment equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea -d4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 176087</td>
			<td>deuterated Urea salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscometer</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>falling ball viscometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy

הפעילות והתפקוד של רוב חלבוני גוף האדם קשורים לשינויים קונפיגורטיביים של תת-דומיינים שלמים בתוך המבנה הגבישי של החלבון. המבנים הגבישיים בונים את הבסיס לכל חישוב המתאר את המבנה או הדינמיקה של חלבון, רוב הזמן עם מגבלות גיאומטריות חזקות. עם זאת, הגבלות אלה מהמבנה הגבישי אינן קיימות בתמיסה. מבנה החלבונים בתמיסה עשוי להיות שונה מהגביש עקב סידור מחדש של לולאות או תת-דומיינים בסולם הזמן של פיקו לננו-שניות (כלומר, משטר הזמן הפנימי של דינמיקת חלבונים). העבודה הנוכחית מתארת כיצד ניתן לגשת להילוך איטי על צירי זמן של כמה עשרות ננו-שניות באמצעות פיזור נויטרונים. בפרט, האפיון הדינמי של שני חלבונים אנושיים עיקריים, חלבון בעל הפרעה פנימית חסר מבנה משני מוגדר היטב וחלבון נוגדן קלאסי, מטופל על ידי ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים (NSE) בשילוב עם מגוון רחב של שיטות אפיון מעבדה. תובנות נוספות על הדינמיקה של תחום החלבונים הושגו באמצעות מודלים מתמטיים כדי לתאר את נתוני הנייטרונים הניסיוניים ולקבוע את ההצלבה בין תנועות חלבונים מפוזרות ופנימיות משולבות. מיצוי התרומה הדינמית הפנימית לפונקציית פיזור הביניים המתקבלת מ-NSE, כולל ציר הזמן של התנועות השונות, מאפשר ראייה נוספת של התכונות המכניות של חלבונים בודדים ורכות החלבונים בסביבתם הכמעט טבעית בתמיסת החלבון הצפופה.

חלבון IgG מסרום אנושי וחלבוני MBP בקר הוכנסו מחדש בריכוזים גבוהים (כ-50 מ"ג/מ"ל) במאגרי בסיס O D2. מכיוון שהחלבונים הומסו בריכוזים גבוהים, התמיסות שהתקבלו היו תמיסות חלבונים צפופות. הדינמיקה שנחשפה באמצעות NSE סובלת מהסביבה הצפופה שבה שוכנים החלבונים (אינטראקציות של גורמי מבנה והשפעות הידרו...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy at JoVE.com

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לחקר המבנה והדינמיקה של שני חלבוני מודל שיש להם תפקיד חשוב בבריאות האדם. הטכניקה משלבת אפיון ביופיזי עם ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים כדי לגשת לדינמיקה בזמן ובקני המידה של האורך הרלוונטיים לתנועות אינטרדומיין של חלבונים.

חקר דינמיקת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

הפרוטוקול הבא מציג כיצד להגדיר ניסוי Neutron Spin Echo כדי למדוד את פונקציית פיזור הביניים ולחקור את הדינמיקה של חלבונים בתמיסה. היתרון העיקרי של ספקטרוסקופיית הד הספין של נויטרונים הוא יכולתה לבחון סידור מחדש של תחומי חלבונים ותת-תחומים בסולם הזמן של פיקו לננו-שניות,שהוא טווח ההילוך האיטי בחלבונים בסביבתם הכמעט טבעית, ובתמיסת החלבון הצפופה. Neutron Spin Echo רגיש גם לתצורה איזוטופית, המאפשרת מחקרים מאוד ספציפיים וממוקדים באמצעות התאמת ניגודיות.תובנות על דינמיקה של תחום החלבונים הן חלק מרכזי במחקר הביופיזי במשימה הקשה המתמשכת להעביר את תנועות התחום של החלבונים עם הפונקציונליות הביולוגית שלהם. הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מיושם באופן כללי על כל מדידת Neutron Spin Echo המבוצעת בספקטרומטר SNS-NSE, ללא קשר לבחירת הדגימות שלך, אם אחת מהן נשארת בתחום החומרים החומר הרך. כדי להגדיר את הניסוי התחל על ידי בחירת עובי טעינת דגימת התא, בהתבסס על ריכוז דגימת החלבון, הטמפרטורה הדרושה למדידה וכמות התמיסה הזמינה.נקו את התא עם חומר ניקוי כלים ללא פוספט, מים שעברו דה-יוניזציה ו-70% דיאטנול. מייבשים את התא בתנור הסעה. מעמיסים ארבעה מיליליטרים של תמיסת חלבון לתוך התא, וסוגרים עם כובעים.השתמש בסרט שעווה או בחומר איטום כלשהו כדי לאטום את תאי הדגימה. טען ארבעה מיליליטרים של חיץ דיאליזה למיכל זהה לזה של דגימת החלבון והאטימה. העברת דגימות לקו הקרן.סגור את התריס, והיכנס לאזור המערה של מתחם הספקטרומטר. הרכיבו את תא הדגימה על מחזיק דגימת האלומיניום על ידי הידוק הברגים ולוחות האחיזה. הרכיבו את דגימת הגרפיט ואת דגימת אבקת תחמוצת האלומיניום המועמסת במיכל זהה לזה של דגימת החלבון.הניחו את אותו מחזיק על ידי החלקה עדינה שלו לתוך פחית מערכת כפיית הטמפרטורה. סגור את מכסה המערכת מכריח הטמפרטורה, והגדר את הטמפרטורה לערך הרצוי על ידי גישה למסך האינטראקטיבי של מערכת כפיית הטמפרטורה. הרכיבו את מצלמת הנייטרונים ליישור הדגימות לקרן.כדי לאסוף את נתוני הספקטרוסקופיה של Neutron Spin Spin Echo, יישרו את הדגימה בקרן הנייטרונים באמצעות מצלמת הנייטרונים, וארבעת מפתחי הדגימה הבלתי תלויים. פתח את מקור הנייטרונים של Spallation, את תוכנת איסוף הנתונים של Neutron Spin Echo Spectroscopy, ואסוף סטטיסטיקות דגימה על ידי הרצת סריקות סטייה עבור זוויות הפיזור ואורך הגל הרצויים. הגדר את פרמטרי המדידה בהתבסס על הנתונים הסטטיסטיים שנאספו עבור כל דגימה על-ידי עריכת פקודות המאקרו של המדידה שסופקו על-ידי מדען המכשיר המסייע.התחל לסרוק על ידי הקלדת שם הפרוטוקול במנחה הפקודה ורכישת הדים עבור המדגם. היכנס לאשכול הניתוח מרחוק של Neutron Sciences עם אישורי המשתמש של ORNL ולחץ על לחצן ההפעלה. בספריית המשתמש, פתח חלון מסוף והקלד את פקודת הגדרת התוכנה.לאחר מכן, הקלד את פקודת הסביבה. צור תיקיה להפחתת הנתונים בספריית הבית והעתק את קבצי ה- Script ופקודות המאקרו שסופקו מהספרייה המשותפת. ערוך, שנה את שמו ושמור את מאקרו ההפחתה המסופק בהתאם.הקלד drspine"במנחה הפקודה והקש Enter כדי להתחיל את סביבת הפחתת התוכנה. הקלד את שם מאקרו ההפחתה במבקש הפקודות בסביבת התוכנה והקש Enter. ערוך את סקריפט Python שסופק על-ידי מדען המכשירים המסייעים עם שמות נתוני הקובץ המופחתים.ערוך את הפונקציה כך שתתאים מהספריה שסופקה. הקלד את שם קובץ ה- Script הערוך במבקש הפקודות והקש Enter כדי לקרוא, להתאים ולהתוות נתוני NSE מופחתים. פונקציית פיזור הביניים שנמדדה על ידי NSE עבור חלבוני IgG ו-MBP מראה סטייה ברורה מתהליך הרפיה פשוט דמוי דיפוזיה בסולם הזמן הקצר של ארבע שנים, מה שמעיד על הנגישות של הדינמיקה הפנימית של חלבונים על ידי NSE, ועל הצורך במודל מורכב יותר לתיאור התהליכים הדינמיים הנצפים.התוצאות של חישובי פונקציות פיזור ביניים שהותקנו על ידי מודלים אטומיים של שני החלבונים באמצעות מודלים שפותחו על ידי היו בקנה אחד עם נתוני NSE הניסוייים. התוצאות הוכיחו כי ניתן לייחס דינמיקה איטית יותר שנצפתה בזמנים פרוותיים ארוכים יותר לתהליכי הדיפוזיה התרגומיים והסיבוביים הכוללים, בעוד שניתן לייחס את הדינמיקה שנצפתה בסקאלות הזמן הקצרות לדינמיקה של תחומי חלבונים. דבר אחד שחשוב לזכור הוא הצורך בדגימות מוכנות ונקיות למדידות NSE.לדוגמה טובה עבור ספין אקו יש יחס היפוך גבוה משלוש, שהוא היחס בין פיזור קוהרנטי לפיזור לא קוהרנטי של המדגם. כמו כן, במהלך הכנת הדגימה וטעינת הדגימה לתאי ה-NSE, יש לשמור על תמיסת הדגימה בטוחה ונקייה מכל זיהום צולב כימי או ביולוגי. מטעמי בטיחות יש לנסות את הכניסה למתחם הספקטרומטר רק לאחר סגירת התריס, והותר זמן נוסף של חצי שעה לקירור קרינה של המארז.פיזור נויטרונים בזווית קטנה מומלץ להעריך את הצורה והמבנה של חלבונים בתמיסה מרוכזת. זה יכול להיעשות לפני או במקביל לניסוי NSE. שיטות נוספות כמו פיזור אור דינמי ומדידות צמיגות מספקות מידע על הדיפוזיה התרגומית ועל האינטראקציה ההידרודינמית בתוך תמיסת החלבון המרוכזת, ומומלצות גם הן.

Research

JoVE Journal

Engineering

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Echo Particle Image Velocimetry

הד Velocimetry תמונת חלקיקים

The transport of mass, momentum, and energy in fluid flows is ultimately determined by spatiotemporal distributions of the fluid velocity field.1 ...

Angle-resolved Photoemission Spectroscopy At Ultra-low Temperatures

Angle-resolved ספקטרוסקופיה Photoemission בטמפרטורות נמוכות במיוחד

The physical properties of a material are defined by its  electronic structure. Electrons in solids are characterized by energy (&omega;)  and momentum ...

Gradient Echo Quantum Memory in Warm Atomic Vapor

Gradient Echo קוונטית זיכרון בחם אטומי החמקן

Gradient  echo memory (GEM) is a protocol for storing optical quantum states of light in  atomic ensembles. The primary motivation for such a technology ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

מדידת חומר מיקרו תחת זרם באמצעות 1-2 מטוס זרימה קטן זווית ניוטרון פיזור

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Using Neutron Spin Echo Resolved Grazing Incidence Scattering to Investigate Organic Solar Cell Materials

באמצעות נויטרונים ספין הד נפתרה שכיחות מרעה פיזור לחקור חומרים אורגניים תאים סולאריים

The spin echo resolved grazing incidence scattering (SERGIS) technique has been used to probe the length-scales associated with irregularly shaped ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

טכניקת הדמיה מהירה ללמוד טיפת השפעת דינמיקה של נוזלים ללא הניוטונית

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

העברת פרוטון והחלבון Dynamics קונפורמציה בחלבונים רגישים לאור בזמן נפתר-Step-לסרוק פורייה-להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

In Situ Neutron Powder Diffraction Using Custom-made Lithium-ion Batteries

באתרו ניוטרון אבקת השתברות שימוש בסוללות ליתיום-יון מתוצרת מותאמת אישית

Li-ion batteries are widely used in portable electronic devices and are considered as promising candidates for higher-energy applications such as electric ...

Free-form Light Actuators &#8212; Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

Free-form Light Actuators ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â Fabrication and Control of Actuation in Microscopic Scale

מתנעים אור בצורה חופשית - ייצור ובקרה של Actuation ב בקנה מידה מיקרוסקופי

Liquid crystalline elastomers (LCEs) are smart materials capable of reversible shape-change in response to external stimuli, and have attracted ...

Recombination Dynamics in Thin-film Photovoltaic Materials via Time-resolved Microwave Conductivity

Dynamics רקומבינציה ב חומרים פוטו סרט דק באמצעות מוליכות מיקרוגל זמן נפתרה

A method for investigating recombination dynamics of photo-induced charge carriers in thin film semiconductors, specifically in photovoltaic materials ...