Name: study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00
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Questa ricerca ha utilizzato risorse presso la Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, laboratori di biologia e chimica), un ufficio DOE della Science User Facility gestito dall'Oak Ridge National Laboratory. Questa ricerca ha utilizzato anche risorse del reattore MLZ-FRM2 garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) e del JCNS1 presso Forschungszentrum Jülich GmbH, Germania. L'autore riconosce il Dr. Ralf Biehl e il Dr. Andreas Stadler per il loro aiuto con la modellazione e il loro contributo alla ricerca sulle proteine IgG e MBP, il Dr. Piotr A. Żołnierczuk per il supporto alla riduzione dei dati NSE, il Dr. Changwoo Do per il supporto con le misurazioni SANS e Rhonda Moody e il Dr. Kevin Weiss per il supporto del laboratorio di biochimica SNS.

Il presente lavoro caratterizza due proteine: una proteina anticorpale umana regolare IgG e l'MBP intrinsecamente disordinata. La forma liofilizzata delle proteine è stata ottenuta da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione del campione proteico
<ol><li>Preparare un tampone da 50 mM di fosfato di sodio + 0,1 M naCl pesando e sciogliendo i rispettivi reagenti solidi in acqua pesante (D2O) (vedi Tabella dei materiali...

La spettroscopia NSE offre una visione unica e dettagliata della dinamica delle proteine, che altre tecniche spettroscopiche non possono produrre. Le misurazioni su una scala temporale estesa forniscono osservazioni della diffusione traslazionale e rotazionale delle proteine, come presentato qui. La dinamica segmentale e altre oscillazioni interne si rivelano come un forte decadimento della funzione di scattering coerente S(Q, t) su scala temporale breve e sono ben separate dai processi generali di rilassamento ...

Sondare la dinamica della materia soffice con neutroni Studiare le proprietà dinamiche di proteine e peptidi è una parte importante della ricerca biofisica e oggi esistono molti metodi ben sviluppati per accedere a una vasta gamma di paesaggi energetici1. Mettere in relazione la dinamica sperimentalmente rivelata delle proteine con la loro funzione biologica è un compito molto più difficile, che richiede complessi modelli matematici e simulazioni dinamiche assistite da computer. L'importanza della spettroscopia neutronica per l'analisi dei moti proteici è stata sottolineata in diversi studi ben accolti e ampiamente riconosciuti 1,2,3,4,5. Prima di esplorare il variegato panorama energetico della dinamica proteica interna, è necessaria una breve panoramica dei processi dinamici nella materia soffice e di come i neutroni possono accedervi.
La sensibilità dei neutroni alla configurazione isotopica e il tipo di interazioni che mostrano con la materia soffice rende lo scattering neutronico una delle tecniche di indagine più versatili6. Esiste un ampio spettro di scale di lunghezza di correlazione e tempi di correlazione a cui i neutroni possono accedere, dalle eccitazioni nucleari e dalle vibrazioni atomiche ai moti collettivi e ai processi di rilassamento lento come le rotazioni isotrope e i moti diffusivi. Quando si studiano i neutroni sparsi per il loro trasferimento di energia, si possono distinguere tre interazioni principali: lo scattering elastico, in cui non vi è scambio di energia tra neutrone in arrivo e particella nel campione; lo scattering anelastico, con un ampio scambio di energia quantificabile tra neutrone e particella; e il caso peculiare dello scattering quasi-elastico che designa un trasferimento di energia molto piccolo rispetto all'energia neutronica incidente 1,7. Queste interazioni forniscono informazioni precise sul materiale studiato e costituiscono la base teorica di un'ampia varietà di tecniche di scattering neutronico.
Nello scattering elastico, il rivelatore registra le direzioni dei neutroni come un modello di diffrazione, che mostra la posizione degli atomi campione l'uno rispetto all'altro. Vengono acquisite informazioni sulle correlazioni delle posizioni atomiche (cioè l'intensità integrata S(Q) relativa al trasferimento di quantità di moto Q, che riguarda solo le informazioni strutturali). Questo principio costituisce la base della diffrazione neutronica8.
La complessità sorge quando il trasferimento di energia non è più zero a causa di eccitazioni e fluttuazioni interne nel materiale campione. Questo costituisce la base della spettroscopia neutronica, in cui i neutroni sparsi sono studiati in funzione sia del trasferimento di energia E che del trasferimento di quantità di moto Q. Si ottengono informazioni dinamiche e strutturali. La spettroscopia neutronica misura la stessa intensità integrata S(Q) per il trasferimento di energia (cioè la variazione di velocità dei neutroni dovuta allo scattering del campione, S(Q,ω) = S(Q, E), che è anche indicato come fattore di struttura dinamica)9.
Per calcolare lo scattering da un materiale, è più appropriato utilizzare la funzione di correlazione di coppia 7,10. Nel caso della diffrazione, la funzione di correlazione della coppia statica G(r) dà la probabilità di trovare il centro di una particella ad una data distanza r dal centro di un'altra particella. La spettroscopia generalizza la funzione di correlazione della coppia statica e include energia/frequenza/tempo nell'equazione di scattering. La funzione di correlazione di coppia G(r) diventa una funzione del tempo G(r, t), che può essere scomposta in una distinta funzione di correlazione della coppia atomica GD(r, t), e una funzione di auto-correlazione GS(r, t). Questi descrivono due tipi di correlazioni: i moti correlati alle coppie degli atomi che governano lo scattering coerente e l'auto-correlazione che governa lo scattering incoerente10.
Lo scattering coerente è lo scattering da "la media" e dipende dalla fase relativa delle onde sparse. Nel regime di scattering a piccolo angolo, le onde di neutroni sparse da diversi centri di scattering (atomi diversi) interferiscono in modo costruttivo (hanno fasi simili) e il movimento collettivo degli atomi viene osservato con un forte aumento dell'intensità. Lo scattering coerente descrive essenzialmente lo scattering di un singolo neutrone da tutti i nuclei del campione10.
Quando non si verifica alcuna interferenza costruttiva tra le onde di neutroni sparse da centri diversi, un singolo atomo viene seguito nel tempo e si osserva l'auto-correlazione tra la posizione dell'atomo al tempo t = 0 e lo stesso atomo al tempo t. Pertanto, le informazioni sulle posizioni relative degli atomi vengono perse e l'attenzione si concentra solo sulle fluttuazioni locali. La dispersione da fluttuazioni locali governa lo scattering incoerente. Lo scattering incoerente è isotropo, contribuisce al segnale di fondo e degrada il segnale-rumore10,11.
Combinando tutto quanto sopra, distinguiamo quattro principali processi di scattering neutronico10: (1) coerente elastico (misura le correlazioni delle posizioni atomiche), (2) coerente anelastico (misura i moti collettivi degli atomi), (3) elastico incoerente (contribuisce allo sfondo, riduce l'intensità di scattering mediante il fattore di Debye-Waller (DWF) e misura il fattore di struttura incoerente elastica (EISF), descrivendo la geometria dei moti diffusivi in geometria confinata, e (4) incoerente anelastico (misura la dinamica del singolo atomo e l'auto-correlazione).
I processi dinamici a cui i neutroni possono accedere in biologia vanno dallo smorzamento delle vibrazioni atomiche e molecolari a bassa frequenza, all'interazione delle molecole di solvente con le biosuperfici e ai processi di diffusione nello strato di idratazione delle macromolecole e della geometria confinata, ai movimenti diffusivi traslazionali, rotazionali e di burattatura a corto raggio, ai domini proteici e ai moti allosterici1 . L'ampia diversità dei metodi e degli strumenti di neutroni per misurare la dinamica delle proteine si basa su come si ottiene l'acromatizzazione del fascio di neutroni incidente o in uscita e su come viene eseguita l'analisi energetica dei neutroni sparsi. Dagli spettrometri a triplo asse a time-of-flight, backscattering e spin-echo, si possono esplorare processi dinamici con tempi caratteristici compresi tra 1 x 10-14 s e 1 x 10-6 s (da femtosecondi a microsecondi)12.
L'Oak Ridge National Laboratory, con le sue due rinomate sorgenti di neutroni, la Spallation Neutron Source - SNS13 e l'High Isotope Flux Reactor - HFIR14, ha una delle migliori suite di spettrometri per lo studio della dinamica nei biomateriali. Alcuni degli esempi più eloquenti includono l'uso dello spettrometro chopper a neutroni freddi (CNCS) a SNS15 per studiare la perturbazione dinamica dell'acqua di idratazione intorno alla proteina fluorescente verde nella soluzione16 o le vibrazioni collettive sub-picosecondi di diverse proteine17. Un problema ricorrente delle indagini anelastiche sullo scattering dei neutroni è che alcuni processi biologici sono troppo lenti per essere osservati. Senza configurazioni estreme che portano a un'enorme perdita di intensità neutronica, gli spettrometri a tempo di volo sono limitati a una risoluzione di energia di 10 μeV, corrispondente a una scala temporale massima di ~ 200 ps10,11. Questo non è sufficiente per osservare movimenti su larga scala nelle proteine. Pertanto, sono spesso necessari strumenti con una risoluzione energetica più elevata come gli spettrometri backscattering. La combinazione del tempo di volo e delle tecniche di backscattering si è dimostrata efficace per studiare il cambiamento nella dinamica interna del citocromo P450cam (CYP101), un enzima che catalizza l'idrossilazione della canfora18.
La diffusività microscopica misurata dallo spettrometro retrodiffusante di SNS-BASIS19 era sorprendentemente ben definita e poteva essere separata nella diffusività dell'acqua (idratazione, citoplasmatica e acqua simile alla massa) e nella diffusività dei costituenti cellulari nei platelminti planari, il primo animale vivente ad essere studiato mediante scattering neutronico20 . Il backscattering è una tecnica spettroscopica ad alta risoluzione, ma è anche limitata a diversi μeV = diversi nanosecondi, mentre la dinamica lenta nei biomateriali si manifesta anche come il tempo di sopravvivenza della correlazione tra posizione atomica o orientamenti di spin (ad esempio, processi di rilassamento, che si verificano regolarmente nell'intervallo di tempo da dieci a centinaia di nanosecondi).
La spettroscopia eco di spin neutronico (NSE) è l'unica tecnica di scattering neutronico a raggiungere una risoluzione così elevata. A differenza di altre tecniche neutroniche, NSE non richiede l'acromatizzazione del fascio poiché utilizza la fase meccanica quantistica dei neutroni, che è i loro momenti magnetici. La manipolazione dei momenti magnetici consente l'uso di un'ampia distribuzione della lunghezza d'onda del fascio di neutroni, mentre la tecnica è sensibile a variazioni di velocità di neutroni molto piccole nell'ordine di 1 x 10-4. NSE è stato utilizzato con successo per studiare la lenta dinamica delle proteine in soluzione per molte proteine. Tra questi numerosi studi pionieristici, riconosciamo lo studio della flessibilità segmentale dell'immunoglobulina21 suina; i moti del dominio accoppiato nella Taq polimerasi22; i moti di dominio nel tetramero del lievito alcol deidrogenasi23; il cambiamento di conformazione della fosfoglicerato chinasi in base al legame del substrato3; l'attivazione dei moti di dominio e la propagazione dinamica dei segnali allosterici nella proteina 4,24,25) di regolazione dello scambio Na+/H+(NHERF1); la dinamica di uno stato compatto di ione reduttasi mercurico26; e la diffusione dell'emoglobina nei globuli rossi27. Due studi più recenti sulla dinamica delle proteine hanno esposto la flessibilità dell'anticorpo umano Immunoglobulina G (IgG) come molla entropica28 e le caratteristiche del contributo del solvente alla dinamica della proteina basica della mielina intrinsecamente disordinata (MBP)5.
Il presente articolo spiega i principi di base dell'NSE, i molteplici metodi preparatori raccomandati per un'indagine approfondita della dinamica delle proteine, nonché la metodologia e il protocollo sperimentale per l'acquisizione dei dati NSE presso lo spettrometro NSE di SNS, SNS-NSE. Il protocollo caratterizza due proteine: IgG, una normale proteina anticorpale umana, e la proteina intrinsecamente disordinata MBP. Le implicazioni biofisiche, la rilevanza della ricerca degli esempi e i limiti della tecnica sono discussi brevemente.
Spettroscopia NSE, il metodo per le misure di dinamica lenta NSE è una tecnica polarizzata che utilizza il tempo di volo dei neutroni per misurare lo scambio di energia (perdita di polarizzazione) dovuto all'interazione quasi elastica tra neutroni e atomi in un campione. Al centro della spettroscopia NSE si trovano due principi di base: (1) la capacità dello spin neutronico di precedere nel campo magnetico con una frequenza proporzionale alla forza <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61862/61862eq01.jpg" style="margin: auto;">magnetica, vale a dire la frequenza di Larmor29, e (b) l'eco di spin o eco di Hann, che rappresenta la manipolazione e la rifocalizzazione del segnale di polarizzazione quando si applica una serie di impulsi a radiofrequenza30.
Le basi del processo NSE possono essere riassunte in pochi semplici passaggi 6,11 utilizzando la Figura 1. (1) Il fascio di neutroni prodotto dalla sorgente (posizione 1) è polarizzato (posizione 2), guidato e trasportato (posizione 3) e arriva all'ingresso dello spettrometro NSE, dove viene ruotato di 90° dal primo pi-mezzo flipper (posizione 4). (2) Il fascio polarizzato (ad esempio, momenti magnetici di neutroni) diventa perpendicolare alle linee del campo magnetico del primo magnete (prima zona di precessione, posizione 5) e inizia a precedere. (3) Alla fine del magnete, gli spin dei neutroni accumulano un certo angolo di precessione proporzionale all'intensità del campo magnetico e al tempo di volo trascorso all'interno (fondamentalmente inversamente proporzionale alla velocità del neutrone). Le singole velocità dei neutroni sono codificate all'interno del loro angolo di precessione alla fine della prima zona di precessione. (4) Vicino alla posizione del campione, il pi-flipper (posizione 6) inverte l'orientamento dello spin di 180°, cambiando il segno dell'angolo di precessione. (5) I neutroni interagiscono con le molecole del campione (posizione 7) e si disperdono. (6) I neutroni sparsi entrano e precedono nella seconda zona di precessione (posizione 8) ma diventano orientati inversamente. (7) Un'altra pinna pi-mezza (posizione 9) viene utilizzata per ruotare l'orientamento dello spin dalla direzione perpendicolare a quella orizzontale. Questo fermerà la precessione, traducendo l'angolo di precessione φ in polarizzazione proporzionale a cos(φ). (8) L'analizzatore (posizione 10) seleziona i neutroni in base a un orientamento. Se l'interazione con il campione è elastica, la velocità del neutrone non cambierà. I neutroni trascorreranno una quantità identica di tempo volando nella prima e nella seconda zona di precessione e gli angoli di precessione accumulati saranno completamente recuperati. La polarizzazione completa viene ripristinata sul rivelatore (posizione 11) come eco della polarizzazione originale (cioè spin-echo). (9) Tuttavia, in NSE, lo scattering è quasi elastico, quindi un piccolo scambio di energia tra neutroni e molecole campione porta a diverse velocità di neutroni dopo la dispersione da parte del campione. A causa delle diverse velocità, i neutroni trascorreranno un ulteriore tempo volando attraverso la seconda zona di precessione e non avranno recuperato correttamente il loro angolo di precessione. Una polarizzazione parziale viene recuperata sul rivelatore e la perdita di polarizzazione dovuta al rilassamento dello spin è proporzionale alla trasformata cos-Fourier della funzione spettrale S(Q, ω), alla funzione di scattering intermedia F(Q, t). (10) Il parametro temporale della funzione F(Q, t) è proporzionale all'intensità del campo magnetico di precessione. La scansione della perdita di polarizzazione in funzione dell'intensità del campo magnetico produce, quindi, una funzione di rilassamento che dipende dai processi dinamici all'interno del campione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig01.jpg"> Figura 1: Fotografia dello spettrometro NSE a SNS (SNS-NSE) e schema del percorso di volo dei neutroni con i componenti funzionali più importanti. Da destra a sinistra: 1 = sorgente di neutroni; 2 = choppers-bender-polarizer-sistema otturatore secondario; 3 = guide di trasporto del fascio; 4 = pi/2 flipper per il primo giro di 90°; 5 = prima zona di precessione; 6 = pi flipper per rotazione a 180°; 7 = area del campione e ambiente del campione (qui viene mostrato il crioforno); 8 = seconda zona di precessione; 9 = pi/2 flipper per secondo giro di 90°; 10 = analizzatore; 11 = rilevatore. (Si noti che porzioni di 3, così come 2 e 1, sono situate dietro la parete blu all'interno della schermatura; gli elicotteri sono sostituiti da un selettore di velocità per NSE basato su reattore). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine MBP protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1891</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O - heavy water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 151882</td>
			<td>liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionized water</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>for washing / cleanning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS instrument</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>dynamic light scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic scattering standards</td>
			<td>SNS-NSE, ORNL</td>
			<td>-</td>
			<td>Al2O3&#160; and Graphite powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>65350-M</td>
			<td>70% ethanol for cleaning cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG protein solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td>lyophilized powder reconstituted in&#160; D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KWS-2 instrument</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle neutron instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquinox dish detergent</td>
			<td>Alconox</td>
			<td>-</td>
			<td>Phosphate-free liquid lab glassware cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9390</td>
			<td>disodium phosphate heptahydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No.S9888</td>
			<td>sodium chloride salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. S9638</td>
			<td>monosodium phosphate monohydrate salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Catalog number:&#160;ND-2000</td>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutron alignment camera</td>
			<td>NeutronOptics, Grenoble</td>
			<td>NOG210222</td>
			<td>100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M - wax parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td>
			<td>all-purpose laboratory film in cardboard dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-J-NSE Spectrometer</td>
			<td>JCNS outstation at the MLZ,&#160; Garching, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SasView</td>
			<td>https://www.sasview.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXSpace, Anton Paar instrument</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>small angle x-ray instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer dialysis membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88400-88405</td>
			<td>Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS Remote Analysis Cluster</td>
			<td>Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)</td>
			<td>https://analysis.sns.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNS-NSE spectrometer</td>
			<td>ORNL, Oak Ridge, TN, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>neutron spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N.A. PN:28145-501</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Forcing System (TFS)</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Part Number 100004055</td>
			<td>sample environment equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea -d4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Product No. 176087</td>
			<td>deuterated Urea salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscometer</td>
			<td>FZ-J&#252;lich</td>
			<td>-</td>
			<td>falling ball viscometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of protein dynamics via neutron spin echo spectroscopy

L'attività e la funzionalità della maggior parte delle proteine del corpo umano sono correlate ai cambiamenti configurazionali di interi sottodomini all'interno della struttura cristallina della proteina. Le strutture cristalline costruiscono la base per qualsiasi calcolo che descriva la struttura o la dinamica di una proteina, il più delle volte con forti restrizioni geometriche. Tuttavia, queste restrizioni dalla struttura cristallina non sono presenti nella soluzione. La struttura delle proteine nella soluzione può differire dal cristallo a causa di riarrangiamenti di loop o sottodomini sulla scala temporale da pico a nanosecondi (cioè il regime temporale della dinamica proteica interna). Il presente lavoro descrive come è possibile accedere a slow motion su scale temporali di diverse decine di nanosecondi utilizzando lo scattering neutronico. In particolare, la caratterizzazione dinamica di due principali proteine umane, una proteina intrinsecamente disordinata che manca di una struttura secondaria ben definita e una proteina anticorpale classica, è affrontata mediante spettroscopia eco-spin neutronica (NSE) combinata con una vasta gamma di metodi di caratterizzazione di laboratorio. Ulteriori approfondimenti sulla dinamica del dominio proteico sono stati ottenuti utilizzando la modellazione matematica per descrivere i dati sperimentali dei neutroni e determinare il crossover tra i moti diffusivi combinati e i movimenti proteici interni. L'estrazione del contributo dinamico interno alla funzione di scattering intermedio ottenuto da NSE, compresa la scala temporale dei vari movimenti, consente un'ulteriore visione delle proprietà meccaniche delle singole proteine e della morbidezza delle proteine nel loro ambiente quasi naturale nella soluzione proteica affollata.

Le proteine IgG provenienti da proteine MBP sieriche e bovine umane sono state ricostituite ad alte concentrazioni (~50 mg/mL) in tamponi D2O-base. Poiché le proteine sono state disciolte in alte concentrazioni, le soluzioni ottenute sono state soluzioni proteiche affollate. Le dinamiche studiate con NSE soffrono dell'ambiente affollato in cui risiedono le proteine (interazioni fattoriali di struttura ed effetti idrodinamici)5,28,39<sup cla...

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Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

Il presente protocollo descrive i metodi per studiare la struttura e la dinamica di due proteine modello che hanno un ruolo importante nella salute umana. La tecnica combina la caratterizzazione biofisica da banco con la spettroscopia eco-spin neutronica per accedere alla dinamica alle scale di tempo e lunghezza rilevanti per i movimenti interdominio delle proteine.

Studio della dinamica delle proteine tramite spettroscopia eco-spin neutronica

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

Il seguente protocollo presenta come impostare un esperimento Neutron Spin Echo per misurare la funzione di scattering intermedio e studiare la dinamica delle proteine in soluzione. Il principale vantaggio della spettroscopia eco-spin neutronica è la sua capacità di osservare il riarrangiamento di domini e sottodomini proteici sulla scala temporale da pico a nanosecondi, che è la gamma di slow motion nelle proteine nel loro ambiente quasi naturale e nella soluzione proteica affollata. Neutron Spin Echo è anche sensibile alla configurazione isotopica, che consente studi molto specifici e mirati utilizzando la corrispondenza del contrasto.Le intuizioni sulla dinamica del dominio proteico sono una parte importante della ricerca biofisica nel difficile compito in corso di trasmettere i movimenti del dominio delle proteine con la loro funzionalità biologica. Il protocollo qui presentato può essere generalmente applicato a qualsiasi misurazione neutron spin echo eseguita presso lo spettrometro SNS-NSE, indipendentemente dalla scelta dei campioni, se si rimane nel regno dei materiali di materia soffice. Per impostare l'esperimento iniziare selezionando lo spessore del carico del campione cellulare, in base alla concentrazione del campione proteico, alla temperatura necessaria per la misurazione e alla quantità di soluzione disponibile.Pulire la cella con detersivo per piatti privo di fosfati, acqua deionizzata e dietanolo al 70%. Asciugare la cella nel forno a convezione. Caricare quattro millilitri di soluzione proteica nella cellula e chiudere con tappi.Utilizzare film di cera o qualsiasi sigillante per sigillare le cellule del campione. Caricare quattro millilitri di tampone per dialisi in un contenitore identico al campione proteico e al sigillo. Trasportare i campioni alla linea del fascio.Chiudere l'otturatore ed entrare nell'area della grotta del recinto dello spettrometro. Montare la cella del campione sul portacampioni in alluminio stringendo le viti e le piastre di tenuta. Montare il campione di grafite e il campione di polvere di ossido di alluminio caricati in un contenitore identico al campione proteico.Posizionare lo stesso supporto facendolo scorrere delicatamente nella lattina del sistema di forzatura della temperatura. Chiudere il coperchio del sistema di forzatura della temperatura e impostare la temperatura sul valore desiderato accedendo allo schermo interattivo del sistema di forzatura della temperatura. Montare la telecamera a neutroni per l'allineamento dei campioni al fascio.Per raccogliere i dati della spettroscopia neutron spin, allineare il campione nel fascio di neutroni utilizzando la telecamera a neutroni e le quattro aperture di campionamento indipendenti. Aprire la sorgente di neutroni spallazione, il software di raccolta dati per spettroscopia neutronica Neutron Spin Echo e raccogliere statistiche sui campioni eseguendo scansioni di defrazione per gli angoli di diffusione e la lunghezza d'onda desiderati. Impostare i parametri di misura in base alle statistiche raccolte per ciascun campione modificando le macro di misura fornite dall'Assisting Instrument Scientist.Avviare la scansione digitando il nome del protocollo nel prompt dei comandi e acquisendo echi per l'esempio. Accedi al cluster Neutron Sciences Remote Analysis con le credenziali utente ORNL e premi il pulsante della sessione di avvio. Nella directory utente, aprire una finestra del terminale e digitare il comando di configurazione del software.Quindi, digitare il comando ambiente. Creare una cartella per la riduzione dei dati nella home directory e copiare gli script e le macro forniti dalla directory condivisa. Modificare, rinominare e salvare la macro di riduzione fornita di conseguenza.Digitare drspine" al prompt dei comandi e premere Invio per avviare l'ambiente di riduzione del software. Digitare il nome della macro di riduzione nel suggeritore di comandi all'interno dell'ambiente software e premere Invio. Modificare lo script Python fornito da Assisting Instrument Scientist con i nomi dei dati del file ridotti.Modificare la funzione per adattarla alla libreria fornita. Digitare il nome dello script modificato nel prompt dei comandi e premere INVIO per leggere, adattare e tracciare dati NSE ridotti. La funzione di scattering intermedio misurata da NSE per le proteine IgG e MBP mostra una chiara deviazione da un semplice processo di rilassamento simile alla diffusione sulla breve scala temporale di quattro anni, indicando l'accessibilità delle dinamiche interne delle proteine da parte di NSE e la necessità di un modello più complesso per descrivere i processi dinamici osservati.I risultati dei calcoli della funzione di scattering intermedia adattati dalla modellazione atomica di entrambe le proteine utilizzando modelli sviluppati da erano in eccellente accordo con i dati sperimentali NSE. I risultati hanno dimostrato che le dinamiche più lente osservate a tempi più lunghi possono essere attribuite ai processi complessivi di diffusione traslazionale e rotazionale, mentre le dinamiche osservate alle scale temporali brevi possono essere attribuite alla dinamica dei domini proteici. Una cosa importante da ricordare è la necessità di campioni ben preparati e puliti per le misurazioni NSE.Un buon campione per uno Spin Echo ha un rapporto di capovolgimento superiore a tre, che è il rapporto tra scattering coerente e incoerente del campione. Anche durante la preparazione del campione e il caricamento del campione nelle cellule NSE, la soluzione del campione deve essere mantenuta sicura e priva di qualsiasi contaminazione incrociata chimica o biologica. Per motivi di sicurezza, l'ingresso nell'involucro dello spettrometro deve essere tentato solo dopo la chiusura dell'otturatore e un ulteriore tempo di mezz'ora è stato concesso per il raffreddamento delle radiazioni dell'involucro.Lo scattering neutronico a piccolo angolo è raccomandato per valutare la forma e la struttura delle proteine in una soluzione concentrata. Può essere fatto prima o in parallelo con l'esperimento NSE. Metodi aggiuntivi come la diffusione dinamica della luce e le misurazioni della viscosità forniscono informazioni sulla diffusione traslazionale e sull'interazione idrodinamica all'interno della soluzione proteica concentrata e sono anche raccomandati.

Research

JoVE Journal

Engineering

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

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